ナボキシモドは局所 HSV を調節します

Dec 30, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 621 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

腫瘍溶解性ウイルス療法は腫瘍溶解と全身性抗腫瘍免疫を引き起こす可能性がありますが、ウイルス複製の障害と免疫抑制性腫瘍微小環境（TME）を克服する能力が不十分であるため、ヒトにおける治療可能性は限られています。上記の問題を解決するために、我々は、インドールアミン 2, 3-ジオキシゲナーゼ 1 (IDO1) 阻害剤であるナボキシモドが、腫瘍細胞における単純ヘルペスウイルス 1 型 (HSV-1) の複製と HSV-1 を介した腫瘍崩壊を促進し、これが有望な併用療法であることを確認しました。 HSV-1ベースのウイルス療法を使用します。したがって、肝細胞癌 (HCC) ウイルス療法のために、HSV-1 とナボキシモドを一緒に注射可能な生体適合性ヒドロゲル (V-Navo@gel) に充填しました。ヒドロゲルは局所送達リザーバーを形成し、単回投与で腫瘍部位でのウイルスの複製と分布を最大化します。注目すべきことに、V-Navo@gel は HCC 担持マウスの無病生存期間を改善し、マウスを腫瘍再発から保護します。さらに、V-Navo@gel はウサギの同所性肝がんモデルにおいても有効な治療効果を示しました。機構的には、我々の組み合わせ戦略が単一細胞 RNA 配列決定を通じて TME を完全に再プログラムすることをさらに発見しました。これらすべての結果は、ナボキシモドと HSV-1 の組み合わせがウイルス複製を促進し、ヒドロゲルリザーバーを介して腫瘍根絶のために TME を再形成できることを総合的に示しました。

近年、免疫チェックポイント阻害剤（ICI）と養子細胞療法の成功により、がん免疫療法（CIT）は複数のがん種で目覚ましい成功を収めています1。世界で 5 番目に発生頻度の高いがんである肝細胞がん (HCC) に対する免疫療法は、強力な免疫抑制効果を伴う複雑な免疫微小環境による低い奏効率と望ましくない臨床転帰という大きな障害に直面しています 2,3,4。したがって、これらの障害を克服するために、HCC に対する他の免疫療法戦略を開発することが緊急に必要とされています。腫瘍溶解性ウイルス療法は、遺伝子組み換え単純ヘルペスウイルス 1 型 (HSV-1) である T-VEC が黒色腫治療薬として米国食品医薬品局 (FDA) によって承認されて以来、多くの前臨床研究および臨床研究で有望な治療法として浮上しています。 2015年5,6年。 TMEの調節に依存する免疫チェックポイント阻害とは異なり、腫瘍溶解性ウイルスはTMEに影響を与えて抗腫瘍免疫を誘導するだけでなく、がん細胞に対する直接攻撃と死滅を可能にします7。それにもかかわらず、T-VEC で治療された黒色腫患者の持続的寛解率は 16% であり、固形腫瘍では望ましくない臨床転帰があるため、ウイルス療法のさらなる最適化が緊急に求められています 8,9。限られた治療効果は、主に 2 つの理由によって引き起こされます。それは、免疫抑制性の腫瘍微小環境と、免疫系がウイルス感染を除去する抗ウイルス免疫です 10。ただし、抗腫瘍免疫の活性化と抗ウイルス免疫の抑制は TME 内で競合しており、ウイルス療法を最適化するにはそれらの間のバランスを保つための注意深い調整が必要です。

インドールアミン 2,3-ジオキシゲナーゼ 1 (IDO1) は、複数の種類の腫瘍で上方制御されることがわかっている重要な免疫抑制タンパク質です 11、12。 IDO1 は、トリプトファン (Trp) からキヌレニン (Kyn) への変換を触媒することにより、CD8+ T 細胞とナチュラルキラー (NK) 細胞の活性を阻害し、制御性 T 細胞 (Treg) の活性化を改善し、骨髄由来サプレッサー細胞 (MDSC) の動員を促進します。）13、14。したがって、IDO1 阻害剤はいくつかの前臨床研究および臨床研究でテストされ、免疫療法の効果的な戦略であることが実証されています 15,16。この研究では、HSV-1 治療が HCC 細胞における IDO1 発現の上方制御をもたらし、それがさらに腫瘍における HSV-1 複製を制限する免疫系の負のフィードバック機構として機能することを発見しました。したがって、HSV-1 ウイルス療法中に IDO1 を阻害すると、免疫抑制性 TME を調節し、腫瘍細胞におけるウイルス複製を促進するという二重の役割を果たす可能性があり、これにより、HCC 治療において IDO1 阻害剤であるナボキシモドと HSV-1 腫瘍溶解性ウイルス療法を組み合わせる理論的根拠が得られました。

腫瘍部位での局所的な薬物放出とウイルス分布の最大化を達成するために、HSV-1 とナボキシモドを注射用シルクヒドロゲル (V-Navo@gel と呼ばれます) にカプセル化しました (図 1)。われわれは、シルクヒドロゲルが局所送達リザーバーを形成し、その中でHSV-1が十分な細胞傷害能力と腫瘍部位への分布を維持し、その間に末梢臓器へのオフターゲット損傷を軽減することを実証した。我々の戦略は、ヒドロゲルに充填されていないHSV-1またはHSV-1/ナボキシモド混合物では部分的な応答のみが得られたのと比較して、HCC皮下腫瘍の完全な治療応答をもたらしました。さらに、単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) を使用して、腫瘍部位への免疫細胞の浸潤を詳細にプロファイリングし、V-Navo@gel がエフェクター T の蓄積によって支配される免疫細胞集団を再構築することによって免疫抑制性 TME に対抗できることを明らかにしました。細胞とNK細胞。この有益な結果は、ウサギの同所移植 VX-2 肝腫瘍モデルにさらに拡大する可能性があります。まとめると、我々はナボキシモドと HSV-1 の併用がヒドロゲルリザーバーを介して腫瘍溶解性ウイルス療法の有効性を増強することを実証し、この戦略を臨床研究に採用する証拠を提供しました。

腫瘍内注射後、ヒドロゲルは腫瘍部位での HSV-1 を制限し、全身毒性を軽減する可能性があります。腫瘍部位の HSV-1 は免疫抑制タンパク質 IDO1 の発現を誘導する可能性があり、これにより治療効果が損なわれます。したがって、V-Navo@gel から放出されるナボキシモドは IDO1 の酵素活性を阻害し、その後ウイルスの複製と抗腫瘍免疫応答を同時に強化する可能性があります。

抗ウイルス免疫による HSV-1 の除去が HSV-1 ベースのウイルス療法の主要な障害の 1 つであることを考慮して、主要な関与者であるインターフェロン刺激遺伝子 (ISG) の中で HSV-1 の複製を阻害する遺伝子を調査しました。 HSV-1 ベースのウイルス療法の最適化のための抗ウイルス免疫の向上。報告されているISG17の1つであるIDO1の過剰発現が、エンベロープ糖タンパク質gD（図2a）およびHSV-1ゲノムDNA（gDおよびICP47 DNAによって示された、図2b）のレベルで表されるHSV-1複製を阻害することを発見しました。）。ヒトHCC細胞株SMMC-7721とマウス乳がん細胞株4T1では、IDO1の過剰発現がHSV-1複製を阻害するという一貫した結果が得られ、我々の発見の普遍性を示唆しています（補足図1a、b）。さらに、GFPタグ付きHSV-1から生成されるGFPシグナルをHSV-1複製の別の指標として使用したところ、IDO1過剰発現細胞のGFP強度は、HSV-1感染後の野生型細胞のGFP強度よりもはるかに低いことが観察されました（図2c)。 IDO1 は、複数の種類の癌で過剰発現していることが報告されており 15、The Cancer Genome Atlas (TCGA) RNA-Seq データセットと私たちのグループの RNA-seq 結果によれば、IDO1 が HCC 腫瘍組織で上方制御されていることも確認しました (図.2d）。特に、qPCRおよびウェスタンブロッティングは、HSV-1処理が転写レベルと翻訳レベルの両方でHepa1-6細胞のIDO1発現の上方制御を誘導できることも明らかにしました（図2eおよび補足図1c）。したがって、IDO1 は HCC 組織で過剰発現され、HSV-1 治療によってさらに上方制御される可能性があります。これは、腫瘍細胞における HSV-1 の複製を制限する免疫系の負のフィードバック機構として機能します。 IDO1 が抗腫瘍免疫に対して免疫抑制作用があるというこれまでの報告と合わせて、HSV-1 ベースのウイルス療法中に IDO1 をブロックする必要があると考えました。

a – c 空ベクター（VT）またはFlagタグ付きIDO1構築物をトランスフェクトしたHepa1-6細胞をHSV-1に24時間感染させた。 gD、FLAG、GAPDH のウェスタンブロッティング分析。 b gD (左) および ICP47 (右) DNA レベルの RT-qPCR 分析 (n = 3; データは平均値 ± SEM として示されました)。 c GFP 陽性 Hepa1-6 細胞の代表的な蛍光イメージング (左) とフローサイトメトリー分析 (右)。スケールバー: 100 μm。 n = 3。データは平均値 ± SEM として示されました。 d HCCおよびその対応する腫瘍周囲組織におけるIDO1発現は、TCGA HCCコホート（左）およびトランスクリプトームシーケンス（右）によって決定されました。データは平均値±SEMとして示した。 e 20 MOI HSV-1で12時間感染させたHepa1-6細胞をRT-qPCRによりIDO1 mRNAレベルについて分析した（n = 3;データは平均±SEMとして示した）。 f、g Hepa1-6細胞を5MOIのHSV-1または5MOIのHSV-1と1μMのナボキシモド（V-Navo）で処理した。 f 示された時点での gD (左) および ICP47 (右) DNA レベルの RT-qPCR 分析 (n = 3; データは平均 ± SEM として示されました)。 g gD および GAPDH のウェスタンブロット分析。 h 示された処理を行った Hepa1-6 細胞の細胞生存率は、アネキシン V-APC および PI 染色を使用したフローサイトメトリー分析によって決定されました (n = 2; データは平均 ± SEM として示されました)。 i 示された治療から 8 日後の、gD (左) および ICP47 (右) で表される腫瘍内 HSV-1 ゲノム DNA レベルの RT-qPCR 分析 (n = 7; データは平均 ± SEM として示されました)。

ナボキシモドは、選択性の高い IDO1 阻害剤です。 IDO1 が HSV-1 複製を制限できるという上記の発見に基づいて、我々は次に、ナボキシモドによる IDO1 の標的化が HSV-1 複製の阻害と細胞傷害効果を逆転できるかどうかを調査しました。 HSV-1 単独処理と比較して、HSV-1/ナボキシモド混合物 (V-Navo と呼ばれる) は HSV-1 のゲノム DNA レベルと gD タンパク質レベルの劇的な増強を誘導し、ナボキシモドが HSV-1 複製を改善したことを示しました (図2f、g)。一貫して、ナボキシモドがSMMC-7721細胞および4T1細胞におけるHSV-1複製を改善したことをさらに検証しました（補足図1d、e）。また、HSV-1複製に対する2つの追加のIDO1阻害剤IndoximodとEpacadostatの効果も評価しました。結果は、両方の化合物がHepa1-6細胞におけるHSV-1複製を増強できることを示しました（補足図1f）。さらに、HSV-1/ナボキシモド混合物はHepa1-6細胞の細胞生存率を低下させ、ナボキシモドがHSV-1媒介のHCC細胞の腫瘍崩壊を増強したことを示した（図2h）。さらに、皮下HCCおよび4T1マウスモデルは、ナボキシモドの腫瘍内注射が腫瘍部位でのHSV-1複製を増強したことを示した（図2iおよび補足図1g）。まとめると、これらのデータは、ナボキシモドが in vitro と in vivo の両方で HSV-1 の複製および腫瘍溶解効果を強化できることを実証し、HSV-1 とナボキシモドの併用ウイルス療法の可能性と利点を示唆しました。

腫瘍細胞へのウイルス分布を最大化するために、ウイルスの腫瘍内送達システムとして繭から生成されたシルクヒドロゲルを導入しました（図3a）18。シルクヒドロゲルの限定された細胞毒性と優れた生物学的安全性は、Hepa1-6細胞で最初に実証されました（補足図2a）。次に、HSV-1 をシルクハイドロゲル (Virus@gel) にカプセル化し、その生物学的特性を検証しました。 Virus@gel は、注入可能でゼラチン状の特性を示しました (図 3b)。これは、実現可能なヒドロゲル送達システムにとって重要な特性です。 Virus@gel の多孔質ネットワーク構造とヒドロゲル内のビリオン分布は、それぞれ走査型電子顕微鏡と共焦点顕微鏡で検証されました（図 3c、d、および補足図 2b）。レオロジー特性と膨潤特性をさらに評価すると、Virus@gel のゲル状態と膨潤率が低いことが実証され (補足図 2c、d)、良好な機械的特性と材料安定性が示されました。

a シルクゲルの溶液からゲルまでのプロセスのイメージ。 b シルクヒドロゲル (Virus@gel) にカプセル化された HSV-1 の画像は、ゲル化と注射可能性の特徴を示しました。 c Virus@gel の SEM 画像。 d シルクヒドロゲル内で DyLight 550 で標識された HSV-1 の 3D 共焦点イメージング。 e、f 徐放実験におけるGFP陽性Hepa1-6細胞のフローサイトメトリー分析(e)および代表的な蛍光画像(f)。スケールバー: 100 μm。 n = 3。データは平均値 ± SEM として示されました。 g PBS、PBS@gel、HSV-1、または Virus@gel 処理後の細胞生存率は、アネキシン V-APC および PI 染色を使用したフローサイトメトリー分析によって決定されました (n = 3; データは平均 ± SEM として示されました)。 h-j Hepa1-6 腫瘍を有するマウスに HSV-1 または Virus@gel を腫瘍内注射しました。 h 定義された時点での腫瘍部位における DyLight 550 標識 HSV-1 の蓄積。赤い丸は腫瘍部位を示しました。赤い矢印は、腫瘍の外へのウイルスの拡散を示しました。 i HSV-1 または Virus@gel 腫瘍内投与から 8 日後の凍結腫瘍切片の代表的な蛍光イメージング。 GFP シグナルは、HSV-1 に感染した細胞を示しました。スケールバー: 100 μm。 j 定義された時点での gD で表される腫瘍内 HSV-1 ゲノム DNA レベルの RT-qPCR 分析 (n = 8; データは平均値 ± SEM として示されました)。

さらに、シルクヒドロゲルが7日間にわたるビリオンの持続放出をサポートできることを実証しました（図3e、f、補足図2dを参照）。細胞生存率アッセイでは、Hepa1-6 細胞と 4 日間共培養した後、Virus@gel が細胞死の 76.6% を引き起こすことが実証され、Virus@gel の優れた腫瘍溶解効果が示唆されました (図 3g)。さらに、in vivo 動物実験では、シルクハイドロゲルに取り込まれた HSV-1 は注射後 3 日で検出できることが示されましたが、遊離 HSV-1 のシグナルは 3 時間以内に腫瘍部位で急速に弱くなり、シルクハイドロゲルが伸長していることが確認されました。腫瘍部位でのビリオンの局所的な保持（図3h）。一貫して、Virus@gel は、HSV-1 単独治療と比較して、腫瘍部位における HSV-1 の GFP シグナルおよび HSV-1 ゲノム DNA レベルを増強しました (図 3I、j)。上記のデータは、当社のシルクヒドロゲルが腫瘍部位でのウイルスの局所的な保持と複製を強化できることを実証しました。

さらに、シルクヒドロゲルがウイルスの拡散と健康な組織への感染を防止することを実証しました。これは、HSV-1 または Virus@gel の皮下注射後の神経系、血液および末梢臓器内の HSV-1 ゲノム DNA レベルによって示されました。図3a、b)。血液生化学およびマウスの日常的な指標は、Virus@gel の毒性が限定的であることを示しました（補足図 3c）。主要臓器の H&E 画像は、すべてのグループ間で一貫して無視できる損傷を示しました (補足図 3d)。

まとめると、これらの結果は、全身毒性が低く、優れた生物学的安全性を示した Virus@gel が腫瘍部位でのウイルスの分布と複製を劇的に最大化し、ウイルス療法の潜在的な送達プラットフォームとなる可能性があることを示しました。

上記の発見に基づいて、我々は次に、皮下 HCC マウスモデルにおける V-Navo@gel (シルクヒドロゲル内にカプセル化された HSV-1/ナボキシモド混合物) の抗腫瘍効果を調査しました。 C57BL/6 マウスに Hepa1-6 細胞を皮下接種し、単回用量の PBS、HSV-1、HSV-1 を充填したヒドロゲル (Virus@gel)、ナボキシモドを充填したヒドロゲル (Navo@gel)、HSV-1 で治療しました。それぞれナボキシモド混合物 (V-Navo) または V-Navo@gel を加えます (図 4a)。すべてのグループの中で、V-Navo@gel で治療したマウスは腫瘍に対して最も強力な阻害効果を示しました。これは、腫瘍体積の変化（図 4b ～ d）と生存率（図 4e）によって示されました。 V-Navo@gel で治療した 6 匹のマウスのうち 2 匹の腫瘍は完全に根絶され、このグループのすべてのマウスは明らかな体重変動なく腫瘍接種後 40 日間生存しています (図 4d–f)。 4T1 腫瘍モデルでは一貫した結果が得られ、V-Navo@gel 治療により明らかな体重変動なしで腫瘍増殖に対する最も強い阻害効果が得られました (補足図 4)。腫瘍切片の H&E、Ki67、および TUNEL 染色は、V-Navo@gel がすべてのグループの中で腫瘍組織に最も深刻な細胞溶解性損傷を引き起こしたことを示しました (補足図 5)。これらの発見により、V-Navo@gel が HCC 腫瘍の増殖を効果的に防止し、腫瘍細胞の腫瘍溶解を誘導できることが確認されました。

治療手順のスキーム。 b、c 示された治療を受けたマウスの腫瘍体積。括弧内の数字は、モニタリングプロセス全体後の各グループのマウスの腫瘍客観的反応率（ORR）を示しました（グループあたりn = 6マウス、データは平均値±SEMとして表示）。 d 示された治療後にマウスから分離された腫瘍画像。 e 示された治療を受けたマウスの生存曲線（n = 6; データは平均±SEMとして示されました）。 f 接種されたマウスの体重は、測定全体を通じて変化します（n = 6; データは平均±SEMとして示されました）。 g 腫瘍再攻撃モデルのスキーム。 h、i 示された治療を受けたマウスの腫瘍体積（n = 8; データは平均±SEMとして示されました）。 j 示された治療後にマウスから分離された腫瘍画像。 k 代表的なFACSプロット（CD4+またはCD8+細胞でゲート）およびTem（CD62LlowCD44high）、Tcm（CD62LhighCD44high）およびナイーブT細胞（CD62LhighCD44low）のパーセンテージをFACSによって検査しました（n = 3;データは平均値±SEMとして表示）。

次に、V-Navo@gel が HCC 治癒マウスを腫瘍再発から保護できるかどうかを決定するために、腫瘍再攻撃研究を実施しました (図 4g)。 22 日間の観察期間中、V-Navo@gel グループで Hepa1-6 細胞を再投与したすべての腫瘍担持マウスには腫瘍が存在しませんでした（図 4h–j）。腫瘍再発からの防御の根底にあるメカニズムをさらに解読するために、再治療後のマウスの脾臓における CD4+ および CD8+ T 細胞の両方のナイーブ T 細胞 (CD62LhighCD44low)、TCM (CD62LhighCD44high)、および TEM (CD62LlowCD44high) の量を分析しました。実験に挑戦。対照群と比較して、V-Navo@gel はナイーブ T 細胞と TCM の減少を引き起こした一方、CD4+ および CD8+ T 細胞の両方の TEM は増加しました。これは、V-Navo@gel がナイーブ記憶と中枢記憶からの変換を誘導したことを示唆しています。腫瘍再発を迅速に根絶するためのT細胞からエフェクターメモリーT細胞への移行（図4k）。

V-Navo@gel で治療したマウスの腫瘍における免疫集団と腫瘍免疫相互作用のより詳細で公平な分析を行うために、PBS、Virus@gel または V-Navo@gel を腫瘍内に注射し、腫瘍を 1 回解離させました。 - 腫瘍の実質的な退縮はあったものの、完全には根絶できなかった場合の細胞RNAシーケンス（scRNA-seq）。最初に教師なしクラスタリングデータ分析を使用して、全細胞を異なるグループに分離し、腫瘍細胞、骨髄由来細胞、T細胞、NK細胞、線維芽細胞、壁細胞および線維芽細胞の集団が異なる分子シグネチャーで識別されました（補足図6a、 b）。腫瘍浸潤免疫細胞の中で、骨髄由来細胞と T / NK 細胞が主な細胞集団であり（補足図 6c）、各集団の標準マーカーに基づいてさらに分類されました 19、20、21。

次に、コントロール、Virus@gel、および V-Navo@gel グループの scRNA-seq からの T/NK 細胞の教師なしクラスタリングを実施しました。 CD8+ T細胞の4つのクラスター、CD4+ T細胞の3つのクラスター、NK細胞の1つのクラスターを含む合計8つのクラスターが出現し、それぞれが独自のシグネチャー遺伝子を持ちました（図5a、b）。 PBS、Virus@gel、および V-Navo@gel 処理間のこれらのクラスターの比較を図 5c、d に示します。注目すべきことに、NK細胞の集団(クラスターT_6)がV-Navo@gel処理後に濃縮された。 V-Navo@gel は、細胞傷害性 CD8+ CTL (細胞傷害性マーカー Gzmf/d/e およびエフェクターマーカー Ifng/Nkg7 の過剰発現を伴うクラスター T_3) および周期性 CD8+ CTL (細胞周期の過剰発現を伴うクラスター T_1 および T_2) の大幅な濃縮も誘導しました。 DNA複製マーカーCenpf/e、Top2a、Mki67、Npm1、およびRrm2）。機能的な細胞傷害性および増殖性遺伝子発現サインを持つ NK 細胞および CD8+ T 細胞サブセットの劇的な増加は、皮下 HCC マウスモデルにおける V-Navo@gel 治療による有望な腫瘍根絶効果を説明しています。一方、エフェクター T 細胞を活性化し、マクロファージなどの自然免疫細胞を動員することにより抗腫瘍免疫応答の中心となるヘルパー T 細胞 (クラスター T_8) も、V-Navo@gel 処理後に濃縮されました。

T/NK 集団内で特定された細胞クラスターを示す UMAP プロット。 b 各 T/NK クラスター内の選択されたシグネチャ遺伝子の発現を示すバブルヒートマップ。バブルのサイズは、正規化された発現レベルに基づいて色分けされた、発現している細胞のパーセンテージを表します。 c PBS、Virus@gel、および V-Navo@gel 処理間の T/NK 細胞クラスターの比較。 d 治療に基づく各細胞型集団の割合の定量化。 e 骨髄由来集団内の同定された細胞クラスターを示す UMAP プロット。 f 各骨髄由来クラスターにおける選択されたシグネチャー遺伝子の発現を示すバブルヒートマップ。バブルのサイズは、正規化された発現レベルに基づいて色分けされた、発現している細胞のパーセンテージを表します。 g PBS、Virus@gel、および V-Navo@gel 処理間の骨髄由来細胞クラスターの比較。

TME の骨髄系集団が T 細胞免疫に強力な影響を示すことが確立されている 22,23。したがって、本発明者らは、V-Navo@gel ウイルス療法後の骨髄系集団の変化にも焦点を当てた。骨髄由来細胞の教師なしクラスター化では、マクロファージのクラスターが 7 つ、単球のクラスターが 1 つ、DC のクラスターが 3 つを含む、合計 11 個のクラスターが示されました (図 5e、f)。注目すべきことに、CD4+ および CD8+ T 細胞の両方をプライミングし、T 細胞媒介抗腫瘍免疫を直接強化することが報告されている cDC1 (クラスター MD_10) の集団 24 は、PBS グループと比較して V-Navo@gel 処理によって濃縮されました。単一の Virus@gel 処理 (図 5g)。さらに、マクロファージ集団の変化も観察しました（図5g）。マクロファージ M1 および M2 の 2 つの機能表現型は長い間確立されており、M1 マクロファージは抗腫瘍とみなされ、M2 マクロファージは腫瘍形成促進の結果に寄与します。 V-Navo@gelは、M1サイン遺伝子の強力な発現を伴うクラスターMD_3マクロファージの濃縮を引き起こし、これはM1マクロファージもV-Navo@gelによって媒介される抗腫瘍プロセスに参加していることを示唆しました（図5gおよび補足図6d）。。上記の結果は、V-Navo@gel ウイルス療法が cDC1 および M1 マクロファージの骨髄集団を増加させ、したがって抗腫瘍効果に利益をもたらすことを総合的に示しました。

がん細胞の生物活性に対する V-Navo@gel の影響をさらに評価するために、がん細胞で異なる発現を示す遺伝子の GO 分析を実施しました。 GO分析により、免疫細胞の動員、分化、増殖を調節することが以前に認識されていたCCLおよびCXCLサブファミリーの上方制御を伴う、V-Navo@gel処理による細胞走化性プロセスの濃縮が明らかになりました（図6a、bおよび補足図7）。。 CCL/CXCLファミリー遺伝子の上方制御とT細胞由来の抗腫瘍免疫との関係を調べるために、CellphoneDBを実行してがん細胞とT細胞のコミュニケーションを分析しました。リガンド-受容体分析により、CCL2 / CCR2、CXCL10 / CXCR3、およびCXCL11 / CXCR3が、がん細胞と異なるT細胞集団間のクロストークを媒介する主要な相互作用モジュールであり（図6c）、これらのリガンド-受容体ペアの相互作用が強化されたことが明らかになりました。癌細胞とT細胞の間の変化が観察されました（図6d）。したがって、上記のデータは、免疫細胞集団に影響を与えるだけでなく、V-Navo@gel 治療が癌細胞にも影響を与え、腫瘍部位への T 細胞動員を調節することを示唆しました。

a、b V-Navo@gel 対 PBS グループ (a) および V-Navo@gel 対 Virus@gel グループ (b) における、異なる発現遺伝子のジーンオントロジー (GO) 解析における上位 10 の用語。 c がん細胞とさまざまな T 細胞クラスター間のリガンド-受容体相互作用の概要。バブルのサイズは p 値を表します。色は相互作用の平均発現レベルの平均を表します。 d PBS、Virus@gel、および V-Navo@gel のグループにおける癌細胞と異なる T 細胞クラスター間の選択されたリガンド-受容体相互作用。バブルのサイズは p 値を表します。色は相互作用の平均発現レベルの平均を表します。

次に、フローサイトメトリー分析とIHC染色を実行して、scRNA-seqで観察された腫瘍免疫微小環境の全身的変化を確認しました（図7a）。腫瘍流入リンパ節における DC (CD11c+/CD80+/CD86+) の成熟レベルを最初にフローサイトメトリーによって分析しました。注目すべきことに、V-Navo@gel はすべてのグループの中で最高レベルの DC 成熟を引き起こしました (図 7b)。腫瘍切片のNK1.1染色は、V-Navo@gel治療後のNK細胞の腫瘍内浸潤の増加を示し、これはscRNA-seq分析と一致しています（補足図8a）。 V-Navo@gel 処理後の scRNA-seq 解析で CD8+ T 細胞集団の劇的な変化が観察されたため、腫瘍組織内の CD8+ エフェクター T 細胞もフローサイトメトリーと免疫染色によって解析されました。一貫して、FACS と免疫染色の両方で、V-Navo@gel が腫瘍部位での CD8+ T 細胞の浸潤を効果的に促進することが示されました (図 7c、d)。さらに、V-Navo@gel は、PBS グループと比較して、Treg の腫瘍内浸潤を強力に阻害しました (図 7e)。腫瘍溶解物のさらなる分析により、V-Navo@gel が腫瘍部位で炎症促進サイトカイン (IL12 および IFNγ) および活性化 T 細胞のマーカーであるグランザイム B を上昇させる可能性があることが示され (図 7f)、抗炎症作用の上昇を示しています。腫瘍に対する腫瘍免疫反応。さらに、脾臓 T 細胞を使用して ex vivo IFNγ ELISPOT アッセイを実行し、腫瘍特異的 T 細胞の生成を検証しました。当社の ELISPOT アッセイは、V-Navo@gel が Hepa1-6 細胞に対して生成された抗原特異的 CD8+ T 細胞を強力に活性化することを示し、腫瘍特異的細胞傷害性 T リンパ球の生成が成功したことを示しています。それにもかかわらず、主に免疫応答の調整に機能し、IFNγを産生するために強力かつ持続的な活性化を必要とする腫瘍特異的CD4 + T細胞の活性化を観察できませんでした（補足図8b）。 RT-PCR分析では、PBSまたはVirus@gelと比較した場合、V-Navo@gelがCCL2、CXCL10およびCXCL11の上方制御を誘導することも示しました（補足図8c）。この結果は、図 6 の GO 解析および CellphoneDB 解析を裏付け、V-Navo@gel が CCL/CXCL ファミリー遺伝子を上方制御して、より効率的な T 細胞動員を行ったことを示唆しています。全体として、これらの発見は、V-Navo@gel が効果的な HCC ウイルス療法のために腫瘍免疫微小環境を包括的に再プログラムしたことを示唆しています。

a 治療手順中の免疫応答分析のスキーム。 b 代表的なFACSプロット（CD11c + DC細胞でゲート）および表示された治療を受けた腫瘍担持マウスの腫瘍排出リンパ節で誘導されたDC成熟の割合（n = 6;データは平均値±SEMとして示されました）。 c 代表的なFACSプロット（CD3+細胞でゲート）およびCD8+Tリンパ球の割合をFACSによって検査しました（n = 6;データは平均値±SEMとして表示）。 d 示された治療後の腫瘍切片の CD4 (赤)、CD8 (緑)、および DAPI (青) 染色の代表的な画像。スケールバー (上段): 200 μm。スケールバー (下段): 100 μm。 e 代表的なFACSプロット（CD4+細胞でゲート）およびTreg細胞の割合をFACSによって調べました（n = 6;データは平均±SEMとして示されました）。 f 示された治療後のELISA分析による腫瘍溶解物中のサイトカインレベル（n = 6;データは平均±SEMとして示されました）。

臨床応用の可能性をさらに広げるために、大型動物モデルとして肝臓に VX-2 腫瘍細胞誘発癌腫を移植したニュージーランド白ウサギにおける V-Navo@gel の抗腫瘍能力を調べました（図 8a）。我々は最初に、HSV-1がインビトロでVX-2腫瘍細胞に感染して殺すことができることを実証した（補足図9a）。我々はさらに、VX-2 腫瘍細胞における IDO1 と HSV-1 の関連性を検証しました。補足図9bおよびcに示すように、IDO1過剰発現は、ゲノムDNAおよびgDタンパク質のレベルの低下によって示されるように、VX2細胞におけるHSV-1複製を強力に阻害した。一貫して、ゲノムDNAおよびgDタンパク質のレベルの増加によって示されるように、ナボキシモドはVX-2細胞におけるHSV-1複製を改善した（補足図9d、e）。これらの発見は、VX-2 細胞における IDO と HSV-1 との関連を確認し、ウサギ VX-2 癌モデルにおけるさらなる in vivo 研究を裏付けています。インビボ研究のために、ＶＸ－２腫瘍組織を切り刻んで、ウサギ肝臓の露出した左葉に移植した（図８ｂ）。 12 日後、腫瘍の平均体積が 200 mm3 になった時点で、ウサギを PBS、V-Navo、および V-Navo@gel 治療群に無作為に割り付け、超音波画像診断下で腫瘍部位に治療薬を注射しました (図.8c）。図 8d は介入中の超音波画像を示しています。動物の体重を 4 日ごとに監視し、1 つのグループの体重減少が 20% を超えた場合、3 つのグループすべてを屠殺し、腫瘍のサイズと位置を評価するために肝臓を分離しました。 PBS 処理グループのウサギ 1 匹は 21 日目に死亡しました。図 8e に示すように、PBS 処理グループの動物は最も明らかな体重減少 (20% 以上) を示しましたが、V-Navo および V-Navo グループの動物の体重は減少しました。 -Navo@gel 処理グループはほとんど変化しませんでした。剖検では、V-Navo@gel で処理したウサギは、PBS および V-Navo グループと比較して腫瘍に対して最も強い阻害効果を示しました (図 8f、g)。まとめると、これらの結果は、V-Navo@gel がウサギ VX-2 肝臓癌モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を示したことを示しています。

治療手順のスキーム。 b ウサギ肝臓の露出した左葉への VX-2 腫瘍組織の移植手順。 c 超音波ガイド下での注射手順。 d 介入中の超音波画像。 e 全測定中の接種ウサギの体重変化（n = 5; データは平均値±SEMとして表示）。 f 示された治療を受けたウサギの肝臓の転移性結節の数（PBS治療群ではn = 4、V-NavoまたはV-Navo@gel治療群ではn = 5;データは平均±SEMとして示されました）。 g 指定された治療法でウサギから分離された肝臓の画像。

腫瘍溶解性ウイルス療法は、がん免疫療法において大きな可能性を示しています。しかし、免疫エフェクター細胞が「冷たい」腫瘍免疫環境に浸潤して機能する能力が低いことや、ウイルスの増殖を制限するために宿主が開発した抗ウイルス戦略など、大きな課題が依然として存在する。解決策を見つけるために、ウイルスゲノムへの外因性遺伝子の組み込み、免疫チェックポイント阻害剤または免疫エフェクター細胞の養子移入との組み合わせなど、いくつかのアプローチが報告されています25、26。私たちの研究は、HSV-1 と IDO1 阻害剤ナボキシモドの組み合わせによって両方の障害を克服できることを示しました。 IDO1 が病原体の複製を直接抑制する 27 か、T 細胞活性を阻害する 28 ことにより、病原体感染において反対の役割を果たすことは長い間認識されてきました。最近、蓄積された研究により、TME における IDO1 の免疫調節役割が報告されています。これは、Trp 枯渇を誘導することによってエフェクター T 細胞と NK 細胞のアネルギーを引き起こし、Kyn 蓄積によって Treg 分化を促進し、最終的に腫瘍免疫回避につながります 29,30,31。私たちの研究では、HCC細胞に対するHSV-1処理がIDO1発現を上方制御し、IDO1がウイルスを除去する免疫系のネガティブループとしてHCC細胞におけるHSV-1複製を阻害することを実証し、HSV-1感染時のIDO1阻害の需要を高めた。 1ベースのウイルス療法。上記の発見により、HSV-1 と IDO1 阻害剤の併用療法の根拠が得られました。別の研究では、脳腫瘍の治療のために、T 細胞の活性化因子を運ぶ腫瘍溶解性アデノウイルスと IDO1 阻害剤を組み合わせ、抗腫瘍免疫応答の再形成を通じて有望な治療結果を達成しました 32。したがって、HSV-1複製を誘導するために最適なIDO1阻害剤を選択する実験を行ったところ、各EC50の下でインドキシモドまたはエパカドスタットと比較してナボキシモドが最も強い効果を有することがわかりました（図2fおよび補足図1g）。さらに、ナボキシモドがすでに癌治療に私たちのグループで使用されて成功しているという事実も、HSV-1 併用ウイルス療法に他の IDO-1 阻害剤ではなくナボキシモドを選択するという私たちの決定に自信を与えました 33。実際、動物モデルは、HSV-1 とナボキシモドでカプセル化された生体適合性ヒドロゲルが原発性 HCC と腫瘍再発の両方に対して大きな治療可能性を示すことを示しました。

腫瘍溶解性ウイルス療法のほとんどの臨床試験では、腫瘍部位でのウイルス分布を最大化するために反復投与が採用されており、腫瘍内注射が必要な場合には困難が伴います。ここで我々は、ウイルスをシルクヒドロゲルに埋め込む局所送達戦略を提案した。シルクヒドロゲルは、その優れた生体適合性により広範な用途を持つ新規生体材料であり、組織工学や薬物送達の分野で使用されています 34。この研究では、ヒドロゲルは、単回投与後に腫瘍組織に濃縮されたビリオンを持続的に放出するための貯蔵庫として機能しました。蓄積された研究により、シルクエラスチン様ヒドロゲル、ゼラチンヒドロゲルなどを含むさまざまなタイプのヒドロゲルが、抗腫瘍ウイルス療法のためにアデノウイルスをカプセル化するために利用されていることが報告されている35、36、37。我々は、ここで提案した in-situ シルクヒドロゲルが HSV-1 を腫瘍部位に閉じ込めることができ、これにより腫瘍内ウイルス複製がさらに誘導され、末梢臓器感染が制限されることを実証しました。全体として、このヒドロゲルシステムは腫瘍部位でのビリオンの持続的な放出と濃縮を達成することができ、ウイルス療法の普遍的な送達プラットフォームとして他の腫瘍溶解性ウイルスにも適用できるようになります。

単一細胞 RNA シーケンスの分析により、V-Navo@gel で治療された腫瘍で優勢である免疫集団が明らかになりました。以前の研究では、腫瘍溶解性 HSV-1 が CD8+ T 細胞を誘発する可能性を高めることが示されています 38。 scRNA 配列決定と以下の FACS および免疫蛍光アッセイにより、V-Navo@gel が強力な CD8+ T 細胞応答を生成することが示され、これにより腫瘍に対する優れた治療効果が説明されました。主要な抗腫瘍エフェクター細胞として、NK 細胞も V-Navo@gel 処理後に濃縮されました。また、メモリー T 細胞数の増加も見つかりました。これは、観察された腫瘍再発からの保護と一致していました。 scRNA-seq 解析および FACS によれば、V-Navo@gel 処理後に DC サブセットも調節されました。 cDC1 は、CD4+ T 細胞と CD8+ T 細胞の両方に抗原を直接提示し、T 細胞免疫と相乗して最適な抗腫瘍効果をもたらすことが報告されています 24。我々は、V-Navo@gel が cDC1 集団の濃縮を誘導したことを観察しました。これはおそらく、上方制御されたウイルス複製と腫瘍溶解により HSV-1 とナボキシモドの組み合わせが引き起こされ、その後腫瘍抗原の放出の増加につながることが考えられます。

免疫細胞集団に加えて、scRNA-seq により、我々の併用療法が走化性経路の上方制御を通じて免疫抑制性がん細胞も再プログラムされることがさらに明らかになりました。 V-Navo@gel 治療は、T 細胞、B 細胞、骨髄由来細胞の生成と動員を促進する CCL2、CXCL10、CXCL11 などのがん細胞におけるケモカインの発現を誘導しました 39。 CCL2、CXCL10、およびCXCL11は腫瘍内にT細胞を直接動員できますが、CCL2はマクロファージの動員も促進し、その後腫瘍内T細胞浸潤を増加させます40、41、42。実際、細胞間相互作用分析により、V-Navo@gel 治療後、CCL2/CCR2、CXCL10/CXCR3、および CXCL11/CXCR3 ペアを介してがん細胞とさまざまな T 細胞クラスター間のコミュニケーションが増加していることが明らかになりました。 V-Navo@gel によって誘発される T 細胞の腫瘍内浸潤。全体として、scRNA-seq 解析は、抗腫瘍免疫に有利な V-Navo@gel 治療による免疫学的に「コールド」腫瘍から「ホット」腫瘍への再プログラミングを明らかにするのに役立ちました。

まとめると、我々は、HSV-1 とナボキシモドがシルクヒドロゲルを介した併用治療として送達され、免疫抑制腫瘍微小環境を再構築することによって HCC の治療効果を促進できることを実証しました。さらに、この戦略は、癌治療の局所的リザーバーとして、他の免疫療法（養子細胞、免疫チェックポイント阻害剤などを含む）にも適用できる可能性があります。

Hepa1-6 細胞と HEK293T 細胞は、American Type Culture Collection (ATCC) から購入しました。 VX2、SMMC7721、および 4T1 細胞は、中国科学院 (中国、上海) から入手しました。 Vero 細胞は、厦門大学の Jiahuai Han 氏から贈られたものです。すべての細胞は、10% (v/v) ウシ胎児血清 (ExCell、中国) を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) で培養しました。すべての細胞は 37 °C、5% CO2 で維持されました。腫瘍細胞株における IDO1 の一過性トランスフェクションには、メーカーのプロトコールに従ってリポフェクタミン 3000 (Thermo Fisher Scientific) を使用しました。

GFP 配列を G47δ BAC に挿入することによって生成された GFP-HSV-1 は、腫瘍溶解性ウイルスとしてすべての実験設定で使用され、Vero 細胞で増殖しました 43。増幅されたウイルスの力価は、以前に記載されているようにウイルスプラークアッセイを使用してベロ細胞上で決定されました44。 HSV-1 ゲノム DNA レベルを決定するために、TIANamp ゲノム DNA キット (TIANGEN、ドイツ) を使用して、HSV-1 に感染した組織または細胞培養サンプルから HSV-1 ゲノム DNA を抽出しました。次に、HSV-1 ゲノム DNA 分析のために次のプライマーを使用して qPCR を実行しました。

HSV-1 gD: 5'-acgactggacggagattaca-3' および 5'-ggaggcgtacttacaggag-3';

HSV-1 ICP47: 5'-ggtgtggcacatcgaaga-3' および 5'-aacgggttaccggattacg-3'。

カイコのフィブリン溶液は、わずかに変更を加えた以前の研究および我々の公開研究に従って調製されました 18,45。簡単に説明すると、繭 (5 g) を細かく切り、Na2CO3 (20 mM) 溶液中で 30 分間煮沸し、その後 ddH2O ですすいでセリシンタンパク質を 3 回除去しました。次に、抽出された絹フィブロインを 60 °C で 12 時間風乾しました。その後、乾燥シルクフィブロインを60℃で4時間9.3M LiBr塩溶液に溶解し、その後72時間透析(Mw、3.5KDa)してLiBr塩を除去した。得られたシルクフィブロイン溶液を4℃で遠心分離して精製し、さらに使用するために4℃で復元しました。 2 wt% シルクヒドロゲルを得るために、2 wt% シルク溶液を脱ガムし、超音波プローブ (Scientz-IID、寧波 Scientz Biotechnology、中国) を使用して 30% 振幅で 180 秒間超音波処理することによってゲルを調製しました。次いで、得られた溶液を３７℃で熟成させて、２重量％のシルクヒドロゲルを得た。 Virus@gel または V-Navo@gel は、2 wt% シルクヒドロゲルを、示されたウイルス力価を有する同量の GFP-HSV-1 または HSV-1 およびナボキシモドを含む同量の溶液と混合することによって調製しました。

レオロジー特性を評価するために、Virus@gel (2 × 106 pfu) を動的せん断レオメーターに配置してレオロジー実験を実行しました。 Virus@gel の貯蔵弾性率 (G') と損失弾性率 (G") を適切なひずみと応力で測定しました。膨潤性の評価では、シルクハイドロゲルまたは Virus@gel をそれぞれ PBS に入れ、それぞれの重量を測定しました。グループを毎日 1 回測定し、この重量を初期ゲルの重量で割ることにより膨潤率を計算しました。

Virus@gel (2 × 106 pfu) を孔径 8 μm のセルストレーナーに入れました。ストレーナーを 1 × 105 Hepa1-6 細胞で培養した 24 ウェルプレートに埋め込みました。 24 時間ごとに、ストレーナーを PBS で 2 回洗浄し、未感染の Hepa1-6 細胞 1 × 105 個を含む別の 24 ウェルプレートに包埋しました。一方、以前の Hepa1-6 細胞は蛍光イメージングとフローサイトメトリー分析を行って、 GFP陽性細胞。

皮下 Hepa1-6 腫瘍を確立するために、100 μL の滅菌 PBS 中の 3 × 106 マウス Hepa1-6 細胞の接種物を、6 週齢の雌 C57BL/6 マウスの右脇の下に皮下注射しました。皮下 4T1 腫瘍を確立するために、100 μL の滅菌 PBS 中の 3 × 106 マウス 4T1 細胞の接種材料を、6 週齢のメスの Balb/c マウスの右脇の下に皮下注射しました。腫瘍が平均サイズ約 100 mm3 に達したとき、PBS、1 × 107 pfu HSV-1、1 × 107 pfu HSV-1/120 μg ナボキシモド (V-Navo) を腫瘍内注射することにより、マウスを治療グループにランダムに割り当てました。、2% シルクヒドロゲルにカプセル化された 1 × 107 pfu GFP-HSV-1 (Virus@gel)、2% シルクゲルに封入された 120 μg ナボキシモド (Navo@gel) または 1 × 107 pfu GFP-HSV-1/120 μgそれぞれ 2% シルクヒドロゲル (V-Navo@gel) 中のナボキシモド。腫瘍の増殖を 2 日ごとに監視し、次の式を使用して腫瘍体積 (V) を計算しました。

ここで、A と B はそれぞれ腫瘍の長径と短径 (mm) です。マウスの全生存期間を 40 日間モニタリングし、腫瘍が 1500 mm3 に達した時点で終点を決定しました。

腫瘍再攻撃モデルの確立のために、HCC 担持マウスを調製し、上記のプロトコールに従って PBS または V-Navo@gel を投与しました。 14日目に、原発腫瘍を除去するために外科的切除が行われた。 17日目に、100μLの滅菌PBS中の3×106個のHepa1-6細胞をマウスの反対側の脇の下に皮下注射した。その後、再攻撃腫瘍のサイズを 2 日ごとに 40 日までノギスで測定しました。

すべての動物実験は福建医科大学孟超肝胆道の治験審査委員会（IRB）によって承認され、大学のガイドラインに従って実施されました。

Hepa1-6 腫瘍を PBS、Virus@gel、または V-Navo@gel (1 × 107 PFU) で腫瘍内に 12 日間治療しました。次に、腫瘍を解離し、手術後 30 分以内に氷上の sCelLiveTM 組織保存溶液 (Singleron Bio Com、南京、中国) に保存しました。腫瘍を、Singleron PythoN® Automated Tissue Dissociation System (Singleron) により 2 mL sCelLiveTM Tissue Dissociation Solution (Singleron) を用いて 37 °C で 15 分間消化しました。次いで、溶液を５００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで穏やかに懸濁した。次に、Singleron Matrix® Single Cell Processing System (Singleron) を使用して、単一細胞懸濁液 (1 × 105 細胞/mL) をマイクロ流体デバイスにロードしました。続いて、GEXSCOPE® Single Cell RNA Library Kits (Singleron)46 のプロトコールに従って、scRNA-seq ライブラリーを構築しました。個々のライブラリーを 4 nM に希釈し、配列決定のためにプールしました。最後に、Illumina novaseq6000 で 150 bp のペアエンドリードを使用してプールの配列を決定しました。

Raw リードは fastQC および fastP で処理され、低品質のリードが削除されました。ポリ A テールとアダプター配列は Cutadapt によって除去されました。品質管理後、STAR を使用してリードを参照ゲノム mus_musculus_ensembl_92 にマッピングしました。遺伝子数と UMI 数は、featureCounts ソフトウェアによって取得されました。その後の分析のための発現マトリックスファイルは、遺伝子数と UMI 数に基づいて生成されました。

細胞は、200から上位2%の遺伝子数および上位2%のUMI数の間の遺伝子数によってフィルタリングされました。ミトコンドリア含有量が 20% を超える細胞が除去され、サブセット関数を使用してサンプルあたり 6000 個の細胞がランダムに選択されました。次元削減とクラスタリングには Seurat v3.1.2 の関数を使用しました47。すべての遺伝子発現は、NormalizeData と ScaleData を使用して正規化およびスケーリングされました。主成分分析 (PCA) 分析のために、上位 2000 個の可変遺伝子が FindVariableFeautres によって選択されました。セルは、上位 20 の主成分を使用して FindClusters によって分離されました。 UMAP アルゴリズムを適用して、2 次元空間で細胞を視覚化しました。

クラスター内の細胞の 10% 以上で発現され、平均 log(倍数変化) が 0.25 を超える遺伝子は、デフォルトパラメーターを使用した Wilcox 尤度比検定に基づいて、Seurat v3.1.2 FindMarkers によって DEG として選択されました。次に、SynEcoSys データベースまたは以前の文献に従って、DEG で見つかった標準マーカーの発現を使用して、各クラスターの細胞型の同一性を決定しました。

細胞間の相互作用は、Cellphone DB v2.1.0 (https://www.cellphonedb.org/) による既知のリガンドと受容体のペアに基づいて予測されました。ランダム化された細胞同一性における平均リガンド-受容体ペア発現のヌル分布を計算するための順列数は 1000 に設定されました。個々のリガンドまたは受容体の発現は、各細胞型にわたるすべての遺伝子の平均対数遺伝子発現分布に基づくカットオフによって閾値化されました。 p値<0.05および平均対数発現>0.1を有する予測された相互作用ペアは、有意であるとみなされた。

インビボでのＤＣの単離および分析のために、処置の８日後にマウスを屠殺し、腫瘍排出リンパ節を穏やかに粉砕し、４０μｍのフィルターを通して濾過した。次に、細胞を対応する抗体で染色し、フローサイトメトリーで検査しました。フローサイトメトリーに使用される抗体は以下にリストされています: Anti-CD11c-APC (eBioscience, USA); 抗 CD80-PE (eBioscience、米国); 抗 CD86-PE-Cy7 (eBioscience、米国)。 TIL の単離と分析のため、治療 8 日後にマウスを屠殺し、腫瘍を解剖し、重量を量り、機械的に切り刻み、コラゲナーゼ (1 mg/mL、Thermo Fisher Scientific、米国)、ヒアルロニダーゼ (0.2 mg/mL、Solarbio、中国) で処理しました。）および Dnase I（0.02 mg/mL、Sigma-Aldrich、米国）を 37 °C で 2 時間、連続的に撹拌しながら混合しました。次いで、細胞を40μmフィルターに通し、Ficoll-Paque密度勾配遠心分離によって単離した後、対応する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって検査した。フローサイトメトリーに使用される抗体は以下にリストされています:TIL 用の抗 CD3-APC (eBioscience、米国)、抗 CD4-FITC (eBioscience、米国)、および抗 CD8-PE (eBioscience、米国)。 Treg に対する抗 CD25-PerCP-Cy5.5 (eBioscience、米国) および抗 Foxp3-PE-Cy7 (eBioscience、米国)。メモリー T 細胞の単離と分析のために、マウスを規定の時点で屠殺し、脾臓を解剖しました。脾臓細胞を40μmフィルターに通し、Ficoll-Paque密度勾配遠心分離によって単離した後、対応する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって検査した。フローサイトメトリーに使用される抗体は以下にリストされています: 抗 CD3-APC (eBioscience、米国)、抗 CD4-FITC (eBioscience、米国)、抗 CD8-PE (eBioscience、米国)、抗 CD44-PE-Cy7 （eBioscience、米国）および抗CD62L-PerCP-Cy5.5（eBioscience、米国）。酵素結合免疫スポット (ELISPOT) アッセイでは、治療の 8 日後にマウスを屠殺し、脾臓を切除し、選別によって CD8 + /CD4 + T 細胞を単離しました。その後、3 × 104 個の選別された脾臓 T 細胞を 1.5 × 105 個の Hepa1-6 細胞とともに培養し、得られた IFN-γ 分泌を、メーカーの機器に従って ELISPOT キット (Mabtech、3321-4APT-10) によって検出しました。

治療後8日目にマウスから腫瘍を単離した。 30 mg の組織を収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテル (MedChemExpress、中国) を含む RIPA 溶解バッファー (Beyotime Biotechnology、中国) で溶解しました。組織を 5 mm 磁気ビーズを使用して 60 Hz で 6 分間ホモジナイズし、16,000 g で 5 分間、4 °C で遠心分離しました。製造業者の指示に従って、ＥＬＩＳＡ（ＢｏｓｔｅｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）によって、ＩＦＮγ、グランザイムＢ、またはＩＬ１２ｐ７０について上清をプローブした。

示された治療後 8 日目に腫瘍を屠殺時に収集し、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E)、Ki67 (R&D System、米国)、TUNEL (R&D System、米国) および NK1.1 (ThermoFisher、米国) 染色で染色しました。腫瘍切片には、Servicebio (中国) による CD4 および CD8 の免疫蛍光染色も施されました。主要な臓器を同日に採取し、H&E 染色を施しました。

体重約２．５ｋｇのニュージーランド白ウサギを使用した。凍結した VX-2 腫瘍組織を解凍し、1 ～ 2 mm3 サイズの小片に切り刻み、露出した肝臓の左中葉に移植しました。腫瘍の伝播を監視するために超音波イメージングが実行されました。 12 日後、腫瘍の平均体積が 200 mm3 になった時点で、動物を無作為に 3 つのグループに分け、それぞれ PBS、1 × 109 pfu GFP-HSV-1/2.5 mg ナボキシモド (V-Navo) または 1 × 109 pfu を腫瘍内注射しました。 pfu GFP-HSV-1/2.5 mg ナボキシモドの 2% シルクヒドロゲル (V-Navo@gel)。注射は超音波ガイド下で行われた。治療後、動物の体重を 4 日ごとに監視し、1 つのグループの動物の体重減少が 20% を超えた場合、3 つのグループすべてを屠殺し、肝臓を分離しました。

細胞溶解物は、PMSF およびプロテアーゼ阻害剤カクテル (MedChemExpress、中国) を含む RIPA 溶解緩衝液 (Beyotime Biotechnology、中国) で調製され、生成された細胞溶解物のタンパク質含有量は、BCA タンパク質アッセイ (TransGen Biotech、中国) を使用して決定されました。総タンパク質 30 μg を含むアリコートを SDS ポリアクリルアミドゲルにロードし、ニトロセルロース膜に転写しました。メンブレンを 5% BSA で 1 時間ブロックした後、指定した一次抗体で 4 °C で一晩プローブし、続いて HRP 結合二次抗体 (Abcam、1:5000) と室温で 1 時間インキュベートしました。一次抗体は次のとおりです: gD (21719、Santa Cruz、1:500)、DYKDDDDK-Tag (3P8、Abmart、1:1000)、GAPDH (AB0037、Abways、1:10000)、IDO1 (66528、Proteintech、1: 1000）。

サンプルサイズは予備調査の結果から決定されました。各実験に使用された番号は図の凡例に示されています。複数の独立した研究により、一貫した結果が確認されました。データの統計分析は、複数のグループ間の比較には一元配置または二元配置分散 (ANOVA)、または 2 つのグループ間の比較には両側対応スチューデント t 検定を通じて分析されました。生存に関するデータは、ログランク (マンテル-コックス) 検定によって分析されました。 *p < 0.05 は統計的に有意であると設定されました。 **p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。すべてのデータはGraphPad Prismを使用して分析され、少なくとも3回の実験を通じて平均±SEMとして示されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究に関連するすべてのデータは、記事とその補足情報に含まれています。図中のグラフやチャートのソースデータは補足データとして利用できます。元のトリミングされていないウェスタンブロットの画像とFACSのゲーティング戦略は、補足図10および補足図11に含まれています。RNA-seqデータは、Genome Sequencing Achieve for Humanデータベース（https://ngdc.cncb.ac.cn/）に寄託されました。 gsa-human/) アクセッション番号 HRA000464。 ScRNA-seq データは、CRA008926 のアクセッション番号で Genome Sequencing Achieve データベース (https://hgdc.cncb.ac.cn/gsa) に寄託されました。他のデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、中国国家自然科学財団によって支援されました (XL への助成金番号 62175031、QZ への助成金番号 82103317)。福建省優秀青少年科学基金プロジェクト (2022J06034 to DZ)。中国福建省自然科学財団 (助成金番号 2020J02010 to XL、2020J011173 to QZ); 福建省衛生委員会の若年・中年人材育成プロジェクト（2020GGA073からQZ）。福建省科学技術イノベーション共同基金（補助金番号：QZ に対して 2020Y9047、DZ に対して 2021Y9216）。福州市科学財団健康委員会 (YZ への補助金番号 2021-S-wp1)。私たちの研究における動物モデルの構築と診断を支援してくれた福建中医薬大学リハビリテーション医学院の Weilin Liu に心から感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Qiuyu Zhuang、Binyu Zhao。

福建省孟潮肝胆道技術重点研究所の統合イノベーション、福建医科大学孟潮肝胆道病院、福州市、350025、中国

Qiuyu Zhuang、Binyu Zhao、Zhiwen Lin、Yuzhi Liang、Qingfu Zhao、Yunhao Wang、Naishun Liao、Haibin Tu、Youshi Zheng、Yongyi Zeng、Da Zhang & Xiaolong Liu

中国、350116、福州、福州大学、Mengchao Med-X Center

Qiuyu Zhuang、Youshi Zheng、Da Zhang、Xiaolong Liu

福建省肝臓センター、福建医科大学、福州、350025、中国

Qiuyu Zhuang、Binyu Zhao、Zhiwen Lin、Yuzhi Liang、Qingfu Zhao、Yunhao Wang、Naishun Liao、Haibin Tu、Youshi Zheng、Hengkai Chen、Yongyi Zeng、Da Zhang & Xiaolong Liu

福建医科大学第一附属病院、福州市、350025、中国

ヘンカイ・チェン & ヨンイー・ゼン

CAS Key Laboratory of Design and Assembly of Functional Nanotures、Fujian Institute of Research on Structure of Matter、中国科学院、福州、350002、PR China

劉暁龍

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Q. Zhuang、DZ、XL が研究をデザインしました。 Q. Zhuang、BZ、ZL、YL、Q. Zhao、YW、NL、HT、YZ、DZ、HC が実験を実施しました。 Q. Zhuang、BZ、YZ、DZ、XL は結果を分析しました。 Q. Zhuang、BZ、YZ、DZ、XL が原稿を執筆し、査読しました。 XLが研究を監督した。

Da Zhang または Xiaolong Liu との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Yingying Hu と他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: [Zhijuan Qui および Anam Akhtar]。査読ファイルが利用可能です。

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転載と許可

Zhuang, Q.、Zhao, B.、Lin, Z. 他。ナボキシモドは、局所的な HSV-1 複製を調節して腫瘍の免疫微小環境を再構築し、注射用ヒドロゲルによる免疫療法を強化します。 Commun Biol 6、621 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04983-z

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受信日: 2022 年 11 月 6 日

受理日: 2023 年 5 月 25 日

公開日: 2023 年 6 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04983-z

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