敗血症の解決

May 25, 2023

Nature Biomedical Engineering (2023)この記事を引用

235 アクセス

31 オルトメトリック

メトリクスの詳細

免疫麻痺は、外傷、敗血症、その他の重篤な傷害に対する代償的かつ持続的な抗炎症反応であり、日和見感染、罹患率、死亡率のリスクを高めます。今回我々は、培養初代ヒト単球において、インターロイキン 4 (IL4) が急性炎症を抑制すると同時に、訓練された免疫と呼ばれる長期持続する自然免疫記憶を誘導することを示します。この逆説的な IL4 の特徴を in vivo で利用するために、脂質ナノ粒子に統合されるアポリポタンパク質 A1 (apoA1) と IL4 の融合タンパク質を開発しました。マウスおよびヒト以外の霊長類では、静脈内注射された apoA1-IL4 包埋ナノ粒子は、骨髄細胞が豊富な造血器官、特に脾臓と骨髄を標的とします。我々はその後、IL4 ナノ療法が、リポ多糖誘導性過剰炎症を起こしたマウス、生体外ヒト敗血症モデルおよび実験的内毒素血症における免疫麻痺を解決することを実証した。我々の発見は、免疫麻痺による合併症のリスクがある敗血症患者の治療のためのapoA1-IL4のナノ粒子製剤のトランスレーショナル開発を裏付けるものである。

敗血症は、感染に対する宿主の反応の調節不全によって引き起こされる重篤な病状であり、臓器不全や死に至ることがよくあります1。免疫系が病原体を除去できない結果、敗血症患者は過剰な炎症性と免疫抑制性の特徴を同時に経験する可能性があり、この状態の管理は非常に困難になります2、3、4。敗血症患者の最大 30 ～ 40% が、最も重要な免疫麻痺表現型を示します。免疫麻痺は、敗血症などの傷害後の持続的な抗炎症性自然免疫反応を特徴とし 5、患者を再発および二次感染のリスクが高く、臓器の機能不全や死につながることがよくあります 6。

敗血症における免疫反応のバランスを再調整し、免疫療法を通じて患者の転帰を改善する治療戦略はまだ初期段階にあります。最近の実験研究は、自然免疫細胞の長期的な再プログラミング 7,8、「訓練された免疫」9,10 と呼ばれるプロセスが、過度の細菌刺激によって引き起こされる寛容と免疫麻痺を逆転させることができる可能性があることを示唆しています 11。治療的に誘発される訓練された免疫 12 は、理論的には免疫麻痺を克服するための強力な戦略ですが、安全かつ効率的に臨床現場に導入できるアプローチが非常に必要とされています。

過剰炎症と免疫麻痺を同時に解決するという私たちの探求において、訓練された免疫と耐性の調節のためにインターロイキン-4 (IL4) を検討しました。報告されているこのサイトカインの単球に対する直接効果を in vitro で再評価したところ 13、14、15、IL4 が既知の抗炎症効果に加えて、逆説的に訓練された免疫を誘導することを発見しました。我々は、IL4 のユニークな特性を利用して、細菌内毒素 (リポ多糖 (LPS)) による刺激によって誘発される単球の免疫麻痺を克服できるのではないかという仮説を立てました。しかし、天然の IL4 は、その好ましくない薬物動態特性と広範な IL4 受容体 (IL4R) 発現のため、in vivo での骨髄細胞の治療的調節にはあまり適していません。したがって、IL4 を骨髄区画に直接ルーティングすることは、魅力的な治療手段となります。この概念を支持するために、我々は、高密度リポタンパク質の主要なタンパク質構成要素であるアポリポタンパク質 A1 (apoA1) と IL4 の融合タンパク質を開発し、この構築物を「apoA1-IL4」と名付けました16,17。 apoA1-IL4 融合タンパク質は脂質ナノ粒子に容易に組み込まれ、骨髄細胞に結合する IL4 ナノ粒子を生成します。次に、in vivo 陽電子放射断層撮影 (PET) イメージングと ex vivo 定量的ガンマ計数を使用して、マウスおよび非ヒト霊長類における IL4 ナノ粒子の挙動を評価しました。最後に、我々は、多発性翻訳炎症および敗血症のインビボおよびエクスビボモデルにおけるIL4ナノ粒子の治療可能性を研究した。

骨髄細胞免疫学の文脈では、IL4 は主にその抗炎症特性で知られています 13、14、15。したがって、我々はまず、初代ヒト単球における炎症に対するIL4のいくつかの既知の阻害効果を検証しました（図1a）。 IL4 (25 ng ml-1) の存在下または非存在下で、Percoll に富んだ単球を LPS で 24 時間刺激しました。予想通り、IL4は炎症促進性サイトカインである腫瘍壊死因子（TNF）とIL6の分泌を強力に阻害しました（図1b）。興味深いことに、IL4処理細胞は、対照と比較して有意に多くのIL-1Raを分泌した(図1b)。活性化骨髄細胞では解糖が上方制御されているため18、IL4または培地対照で処理した他の刺激を受けていない単球における乳酸生成を測定しました。我々は、IL4がベースラインの乳酸生成をわずかではあるが有意に低下させることを発見し（拡張データ図1a）、その急性の抗炎症特性が確認されました。

a、インビトロ直接炎症実験の概略図。 b、ヒト初代単球の24時間刺激後のTNF、IL6およびIL1Raレベル。 c、in vitroで訓練された免疫実験の概略図。 d、β-グルカンで訓練された細胞の再刺激後のTNFおよびIL6レベル。 e、IL4トレーニング細胞の再刺激後のTNFおよびIL6レベル。 f、IL4訓練細胞における解糖代謝（左）およびミトコンドリア代謝（右）のタツノオトシゴ分析。データは平均±標準偏差 OCR、酸素消費率として表示されます。 2-DG、2-デオキシ-D-グルコース。

これらの抗炎症特性に基づいて、IL4 は訓練された免疫の誘導も阻害する可能性があるという仮説を立てました (図 1c)。この仮説を検証するために、典型的な訓練された免疫刺激であるβ-グルカンで単球を24時間訓練し、その後刺激を洗い流し、培地中で5日間休止させた。 6日目に、さらに24時間LPSで細胞を再刺激し、TNFとIL6を測定しました（図1d）。 β-グルカンは予想どおり訓練された免疫を誘導しましたが、最初の24時間のIL4の添加は訓練効果を阻害しませんでした（図1d）。我々の最初の仮説に反して、単球をIL4のみに24時間曝露すると、6日目に訓練された免疫表現型が誘導されました（図1e）。炎症誘発性サイトカインの産生の増強に加えて、IL4で訓練された細胞はベースラインでより多くの乳酸を産生しました（拡張データ図1b）。さらに、IL4で訓練された細胞は、訓練されていない対照よりも熱で死滅したカンジダ・アルビカンスを貪食する効果がわずかに低かった（拡張データ図1c）。まとめると、我々のデータは、IL4 が代謝レベルと機能免疫レベルの両方で炎症を抑制し、訓練された免疫を誘導することを示しています。

これらの観察に励まされて、我々は、IL4 誘発の訓練された免疫後の代謝変化を包括的に研究しました。この目的のために、我々はタツノオトシゴ代謝フラックス分析を使用して、IL4トレーニング細胞および刺激されていないコントロールの解糖代謝および酸化代謝を調べました。 0日目のIL4トレーニングは、6日目に測定された代謝パラメータに顕著な影響を及ぼし（図1f）、基礎解糖が増加する傾向と、オリゴマイシン誘発性の最大解糖能力が大幅に増加する傾向がありました（図1f、左）。さらに、ベースラインおよびカルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン誘発最大呼吸数の両方が、IL4トレーニングによって大幅に増加しました（図1f;右）。

次に、フローサイトメトリーを使用して、単球およびマクロファージのIL4活性化に一般的に関連するいくつかのパラメーターを測定しました（拡張データ図1d）。 IL4 トレーニングにより、6 日目に分化クラスター (CD)14 発現の強い下方制御が引き起こされました。対照的に、CD200R、特に CD206 は、0 日目の IL4 活性化に続いて 6 日目に大幅に増強されました。CD80 は、IL4 トレーニングによってわずかに増加しましたが、全体的にはこれらのナイーブなマクロファージでは発現は依然として低かった。単球由来樹状細胞 (moDC、IL4 + 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) を使用して分化) も CD1c を強力に上方制御する一方で、CD14 を下方制御することが知られています。 IL4で訓練された細胞は、訓練されていない細胞よりわずかに多くのCD1cを発現しましたが、moDCよりははるかに少なかった（拡張データ図1e）。これらの結果は、IL4 が古典的な IL4 免疫学的機能から知られている特徴を組み込んだ訓練された免疫プログラムを誘導することを示しています。

IL4 のシグナル伝達機構は詳しく説明されています。インスリン受容体基質 2-ホスホイノシチド 3-キナーゼ - ラパマイシンの哺乳類標的 (IRS-2-PI3K-mTOR) 軸、およびシグナル伝達物質および転写活性化因子 6 (STAT6) シグナル伝達経路 19 (図.2a)。我々は、急性炎症の阻害とIL4による訓練された免疫誘導の両方に対するこれらの経路の役割を調査するために、薬理学的阻害実験を実施しました。 PI3KまたはmTORの阻害（それぞれワートマニンまたはトリン-1を使用）は、急性炎症に対するIL4の効果を無効にしませんでしたが、訓練された免疫応答を減少させました（図2b、cおよび拡張データ図2a）。 IL4トレーニングは、TNFおよびIL6産生の増加によって測定されるように、torin-1の存在下で著しく鈍化した(図2cおよび拡張データ図2b)。対照的に、STAT6阻害剤AS1517499は、急性炎症反応におけるサイトカイン産生を部分的に回復しましたが、IL4による訓練された免疫誘導には影響を与えませんでした（図2b、c）。したがって、IL4 とその受容体との結合の下流で誘導されるシグナル伝達経路のそれぞれは、異なる機能を持っています。IL4 は、STAT6 を介して既知の急性抗炎症機能を発揮しますが、同時に、これまで知られていなかった炎症促進効果である PI3K-mTOR を介して訓練された免疫を誘導します。

a、前述の主要な IL4 シグナル伝達経路の概略図 19。バイオレンダーを使用して生成されました。 b、主要なIL4シグナル伝達経路を遮断しながら単球を24時間刺激した後のTNFおよびIL6レベル。 c、主要なIL4シグナル伝達経路を遮断しながらIL4でトレーニングした細胞の再刺激後のTNFおよびIL6レベル。 d、再刺激前後のIL4トレーニング細胞のトランスクリプトームのヒートマップ。 e、IL4訓練免疫におけるTFモチーフ濃縮分析（ヒートマップはZスコアを示す）。 f、IL4で訓練された免疫トランスクリプトームの経路濃縮分析。 g、SET7 メチルトランスフェラーゼ阻害剤の存在下で IL4 でトレーニングした細胞の再刺激後の TNF および IL6 レベル。 CPH、シプロヘプタジン。 h、IL4トレーニング細胞におけるTNFのChIP-qPCR AUC分析。棒グラフのデータは平均値 ± SD として表示されます。

IL4トレーニングによって誘導される分子プログラムについての洞察を得るために、6日目のLPS再刺激の前後の両方で、ナイーブマクロファージおよびIL4トレーニングマクロファージに対してトランスクリプトミクス分析を実行しました。全体として、140個の遺伝子がより強く誘導（「上方制御」）されました。 IL4で訓練されたマクロファージに対し、249個の遺伝子が減弱した(図2d)。上方制御される遺伝子の上位には、訓練された免疫に関与することが知られている IL6 や IL12B などの炎症促進性サイトカインがありました 10。顕著な減弱遺伝子の中には、リンパ球輸送とサイトカインシグナル伝達の抑制にそれぞれ重要なCCL19とSOCS2があった 20,21。

次に、トランスクリプトームプロファイルについてのさらなる洞察を得るために、転写因子（TF）モチーフ濃縮分析（図2e）および遺伝子オントロジーおよび経路濃縮分析（図2f）を実行しました。 IL4 で訓練されたマクロファージで上方制御される遺伝子のプロモーターには、活性化転写因子 (ATF)2/ATF7、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ (PPARα)、STAT5 などの TF によって認識されるモチーフが非常に豊富でしたが、インターフェロン制御因子 (IRF) モチーフは特に枯渇している。このパターンは、TATA-ボックス、活性化B細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー（NFκB）-p65、NFκB-p65-Relおよびfos関連抗原2を除き、影響を受けずに弱毒化された遺伝子ではほとんど逆転した：これらのモチーフ減弱された遺伝子プロモーターは非常に豊富でしたが、影響を受けていない遺伝子と上方制御された遺伝子の両方では減少しました（図2e）。遺伝子オントロジー (生物学的プロセス (BP) および分子機能 (MF)) および京都遺伝子およびゲノム百科事典の経路濃縮により、上方制御された経路の両方に免疫学的活性が存在することが示されました (たとえば、BP「生物に対する反応」、京都遺伝子およびゲノム百科事典) 「TNFシグナル伝達」）および減弱された（たとえば、BP「免疫応答」、MF「サイトカイン活性」）遺伝子セット（図2f）。単離直後にIL4、LPS、またはIL4とLPSの組み合わせで刺激した単球に対して同様のトランスクリプトーム分析を実行しました。これにより、IL4に対する急性の抗炎症性トランスクリプトーム応答が確認されました（拡張データ図2c〜e）。これらのデータを総合すると、急性の抗炎症効果と、IL4 によって引き起こされる長期訓練された免疫応答の両方における特異的な転写プログラムが明らかになります。

我々はその後、エピジェネティックな再プログラミング、特にヒストン修飾の重要性と存在を調査しました。抗アレルギー薬のシプロヘプタジン、su(var)3-9、ゼステのエンハンサー、およびリジンメチルトランスフェラーゼ 7 (SET7) (SET9 としても知られる) ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む trithorax ドメインの追加により、訓練された免疫の誘導が無効になりました。 IL4による（図2g）。 SET7 は、訓練された免疫の重要なエピジェネティックメディエーターとして以前に説明されています 22。さらに、IL4誘導訓練免疫におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）-定量的PCR（qPCR）分析を使用して、ヒストン-3-リジン-9-トリメチル化（H3K9me3）を介したTNFの抑制を評価しました。 6つのプライマーペアの曲線下面積（AUC）分析を使用すると、IL4誘導訓練免疫におけるH3K9me3の減少が示されましたが、これは統計的有意性には達しませんでした（図2hおよび拡張データ図2f）。これらのデータを総合すると、エピジェネティックな再プログラミングが IL4 誘導の訓練された免疫にとって重要であり、その特徴であることを示しています。

急性炎症を抑制しながら同時に訓練された免疫を誘導するその能力にもかかわらず、組換え IL4 の臨床応用は、その好ましくない薬物動態特性によって妨げられています。この制限を克服するために、我々は脂質ナノ粒子に容易に統合してIL4含有ナノ粒子（IL4-aNP）を生成するapoA1ベースの融合タンパク質を開発した。 ApoA1 ベースのナノ粒子 (aNP) は本質的に造血器官に蓄積し、骨髄細胞とその前駆細胞を効率的に標的とします 16,23 (図 3a)。具体的には、柔軟なリンカーを介して接続され、N 末端に位置する 6his タグと C 末端にある strep タグの 2 つの精製タグが隣接する、ヒト apoA1 とヒト IL4 (apoA1-IL4) からなる融合タンパク質を設計しました。図3b)。私たちは、分子特性評価技術を使用して、apoA1-IL4 の性質と純度を確認しました。精製した各タンパク質サンプルに対してドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を実行することにより、分子量 25 kDa (apoA1)、18 kDa (IL4)、および 37 kDa (apoA1-IL4) のタンパク質の存在を確認しました (図 3c)、一方、ウェスタンブロットでは apoA1 および IL4 の存在が示されました (図 3d)。その両親媒性の性質により、apoA1 とその誘導体は、同様のサイズのタンパク質と比較して、ゲル電気泳動中により速く泳動します。これらの観察は、四重極飛行時間型（Q-ToF）質量分析法（MS）によって裏付けられ、apoA1-IL4の分子量47,582.57 Daに対応する47,576.03 Daの単一質量ピークを示しました（図3e）。

a、apoA1 ベースの融合タンパク質技術の概略図。 b、apoA1-IL4 融合タンパク質の構造の概略図。 c、d 組換え発現タンパク質のSDS-PAGE（c）およびウェスタンブロット（d）。内因性IL4およびapoA1に特異的な抗体。 e、apoA1 – IL4 のクロマトグラムおよび Q-ToF-MS スペクトル。 f、SPRを使用した、IL4RαへのapoA1-IL4結合の動態。 g、IL4RαおよびIL13Rα1を発現するHEK-Blue細胞のapoA1-IL4による活性化。データは平均±sd DMPC、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンとして示されています。 GGS、グリシン-グリシン-セリン。 RU、共鳴単位。

apoA1 – IL4 を脂質ナノ粒子に組み込む前に、表面プラズモン共鳴 (SPR) および HEK-Blue IL4/IL13 (HEK-IL4) レポーター細胞を使用した生物物理学的および細胞分析を実行して、抽出、精製後の生物活性の保存を確認しました。そしてリフォールディングの工程。 SPRを使用して、ヒトIL4受容体アルファ（IL4Rα）に対するapoA1-IL4の平衡解離定数KDが4.5±1.1nMであると決定しました（図3f）。 HEK-IL4 細胞は、分泌型アルカリホスファターゼ (SEAP) をコードする IL4Rα/STAT6 誘導性レポーター遺伝子を保有しており、培養ウェルに apoA1-IL4 を導入すると顕著に産生されます。これは、apoA1-IL4 の生物学的活性を示しています (図 3g)。 apoA1との融合によりIL4の生物物理学的特性が実質的に変化し、脂質ナノ粒子への組み込みが可能になりましたが、その受容体への結合はKD 0.28±0.1nMで保存されました（拡張データ図3a）。要約すると、我々は、抽出、精製、リフォールディング後にIL4の生物学的活性を保存し、apoA1を介して脂質ナノ粒子に組み込むための望ましい物理化学的特徴を含むapoA1-IL4融合タンパク質を開発した。

IL4 の薬物動態特性と骨髄細胞に対するそのバイオアベイラビリティを改善するために、我々は apoA1-IL4 融合タンパク質を脂質ナノ粒子に組み込み、IL4-aNPs を生成しました16。処方の組成を変えることによって、異なるサイズと形態のナノ粒子が得られました（図4a）。円盤状および球状のナノ粒子の形成は、極低温透過電子顕微鏡（cryo-TEM）によって確認されました（図4b）。さらに、動的光散乱（DLS）を使用して、PBS中でのナノ粒子サイズと安定性を14日間分析しました（図4c、d）。 IL4-aNPは14日間安定であり、以前に報告された従来のaNPと比較して同様のサイズと安定性を持っています（拡張データ図4a、b）。

a、b、円盤状（上のパネル）および球状のIL4-aNP（下のパネル）の概略図（a）および低温TEM画像（b）。 c、d、DLSによって決定されたIL4-aNPの経時的なIL4-aNPサイズ分布（c）および安定性（d）。 IL4-aNP サイズは数値平均として報告されます。 e、蛍光標識されたapoA1(-IL4)または(IL4-)aNP(赤)のいずれかとインキュベートし、抗IL4Rα抗体(緑)で染色したヒト単球の超解像蛍光顕微鏡(dSTORM)画像。タンパク質とIL4Rαの共局在は黄色で確認できます。右側の後続の画像では、白い ROI が拡大されています。データは平均値±標準偏差として表示されます。

次に、IL4-aNP と初代ヒト単球との相互作用を調査しました。直接確率的光学再構成顕微鏡法 (dSTORM) 分析により、膜上の IL4Rα (緑色) の発現が明らかになりました。さらに、細胞表面を覆う縁によって、裸の apoA1、裸の apoA1-IL4、aNP、および IL4-aNP (赤色) の結合が確認されました。膜の拡大部分に焦点を当てると、裸の apoA1-IL4 および IL4-aNP が IL4Rα と会合し、細胞表面に濃縮された共クラスターを形成していることがわかりました。これは、裸の apoA1 および従来の aNP では観察されませんでした。 (図4e)。 DLS サイズ安定性アッセイ、クライオ TEM および dSTORM 分析を総合すると、apoA1-IL4 融合タンパク質を脂質ナノ粒子に組み込むと、生物学的に機能的な IL4-aNP が得られることが明らかになりました。

C57BL/6 マウスの薬物動態と体内分布を調査するために、4 つの異なる IL4 治療薬のタンパク質成分、すなわち裸の IL4、裸の apoA1-IL4 融合タンパク質、円盤状および球状の IL4-aNP をジルコニウム 89 (89Zr) で放射性標識しました。これらの実験は、マウスでは生物活性を示さないIL4のヒト変異体を用いて行われたことに注意してください。静脈内投与後 24 時間のコンピューター断層撮影 (PET-CT) 画像を伴う PET では、89Zr-IL4 および 89Zr-apoA1-IL4 が主に腎臓と肝臓に蓄積していることが示されました。対照的に、89Zr-IL4-aNPは肝臓や腎臓に蓄積するだけでなく、脾臓や骨髄などの免疫細胞が豊富な臓器にも比較的多量に蓄積しました（図5a）。 ex vivoガンマカウントを実行して、ナノマテリアルの血中半減期と主要臓器への取り込みを決定し（図5b、c）、オートラジオグラフィーによって確認しました（拡張データ図5a）。標的臓器（骨髄＋脾臓）による取り込み率をクリアランス臓器（腎臓＋肝臓）で割ったものと比較すると、未製剤の融合タンパク質および裸のIL4と比較して、IL4-aNP製剤の取り込み率の有意な増加が示されました（拡張データ図5c）。次に、フローサイトメトリーを使用して、標的臓器における細胞型特異的な生体内分布を測定しました。 3,3 '-ジオクタデシロキサカルボシアニン過塩素酸塩（DiO）標識された円盤状IL4-aNPは、脾臓と骨髄の両方の骨髄細胞、特に単球と好中球に蓄積しますが、リンパ球とは（またはわずかにしか）相互作用しません（図5d）。）。造血器官におけるその有利な（そして骨髄特異的）取り込みに基づいて、我々は、非ヒト霊長類および炎症および敗血症のトランスレーショナルモデルにおけるさらなる研究のために、円盤状IL4-aNP製剤を選択した。

a、 89Zr 標識構造を注入してから 24 時間後の PET-CT レンダリング。 b、 89Zr 標識構造体の血中半減期 (n = 5、二相減衰関数を当てはめた場合)。 ID、注射量。 c、 89Zr標識構造体注射の24時間後の組織のエクスビボガンマカウント（n = 5）、数字はクリアランス臓器に対する標的の比を表す。 d、フローサイトメトリーで測定した、脾臓および骨髄におけるDiO標識円板状IL4-aNPの細胞型特異的生体内分布。 e、非ヒト霊長類における 89Zr-IL4-aNP 血中半減期。 f、89Zr-IL4-aNPを注射した非ヒト霊長類における経時的な臓器SUV平均（n = 2）。 g、非ヒト霊長類における 89Zr-IL4-aNPs 注射後 48 時間の臓器特異的 SUV 平均 (n = 2)。 h、89Zr-IL4-aNPs注射から48時間後の非ヒト霊長類のPET-MRIスキャン。データは、必要に応じて平均値±標準偏差として表示されます。 DIO、3,3'-ジオクタデシロキサカルボシアニン過塩素酸塩; MFI、平均蛍光強度。 NHP、非ヒト霊長類。

IL4-aNP 免疫療法薬の臨床翻訳可能性を評価するために、ヒト以外の霊長類におけるその生体内分布と安全性プロファイルを決定しました。 2 匹の非ヒト霊長類に 89Zr-IL4-aNP を静脈内注射しました。それらの生体内挙動は、磁気共鳴画像法 (PET-MRI) と組み合わせた完全に統合された 3 次元 PET を使用して研究されました。注射後のダイナミックPET-MRI（拡張データ図5d）は、肝臓、腎臓（拡張データ図5e）、脾臓および骨髄（図5e〜h）におけるIL4-aNPの急速な蓄積を示しました。マウスのデータによれば、脳や心臓などの非標的臓器ではIL4-aNPの望ましくない取り込みは観察されませんでした（拡張データ図5b）。これらの結果を総合すると、IL4-aNP の良好な生体内分布と安全性プロファイルが種を超えて保持されていることを示し、この免疫療法の翻訳可能性を裏付けています。

天然のIL4が同時に急性炎症反応を弱め、訓練された免疫プログラムを誘導することを確立した後、我々はin vitroで単球に対するIL4-aNPの効果を評価しました（図6a）。我々は、裸のIL4と比較した、初代ヒト単球におけるホスホSTAT6誘導の効率に基づいてインビトロ実験の用量を決定しました（拡張データ図6a）。実際、IL4-aNP（200 ng ml -1 の裸のIL4のモル当量）は、LPS刺激単球のTNFおよびIL6産生を大幅に減少させました（図6b）が、6日目の単球の長期応答性を高めました（図6c）。。これらのデータは、IL4-aNP が IL4 と同様に、in vitro で急性炎症を抑制し、訓練された免疫を誘導することを示しています。 in vivo 生体内分布データは、IL4-aNPが骨髄細胞を特異的に標的とすることを示していますが（図5d）、IL4誘導の訓練された免疫は、抗原提示細胞であるマクロファージの表面マーカー発現を変化させます（拡張データ図1d、e）。これは、T 細胞活性化中の分極シグナルに影響を与える可能性があります。 T 細胞に対する IL4-aNP のこれらの潜在的な間接的な効果を調査するために、同種異系ナイーブ T 細胞を IL4 で訓練されたマクロファージの存在下で培養しました。このモデルでは、ヒト白血球抗原の不一致により、抗原非特異的な T 細胞の活性化と極性化が引き起こされます。 T 細胞サブタイプ、Th1 (CD4+ IFNγhigh)、Th2 (CD4+ IL4+)、Treg 細胞 (CD4+ IL10+)、Th17 (CD4+ IL17+)、および細胞傷害性 T 細胞 (CD8+ Granzyme B+ Perforin+) の存在量には、訓練されたマクロファージ間で有意な差は観察されませんでした。およびコントロール (拡張データ、図 6d)。まとめると、これらの発見は、IL4 トレーニングが T 細胞応答を間接的に歪める能力を示さないことを示し、主に骨髄特異的な効果を示唆しています。

a、インビトロでの直接炎症および訓練された免疫実験の概略図。 b. IL4-aNPの存在下で単球を24時間刺激した後のTNFおよびIL6レベル。 c、IL4(-aNP)で訓練された細胞の再刺激後のTNFおよびIL6レベル。 d、IL4ナノ療法を含むマウスのin vivo寛容モデルの概略図。 e、IL4m-aNPで処置したマウスのLPS再チャレンジ後の血清TNFおよびIL6レベル。統計的比較にはマンホイットニー U 検定が使用されました。 f、生体外耐性逆転を含むヒト実験内毒素血症モデルの概略図。 g、ヒトインビボLPS寛容細胞のエクスビボ再刺激後のTNFおよびIL6レベル。 h、TNFおよびIL6は、ヒトin vivo LPS寛容細胞のex vivo再刺激後に増加します。データは平均値±標準偏差として表示されます。

敗血症患者は過剰炎症反応と免疫麻痺の両方を経験する可能性があり、治療上の矛盾が生じます。理論的には、訓練された免疫の誘導を使用して免疫寛容を逆転させることができますが、これは生体内モデルには適用されていません 11。理由の 1 つは、ヒト IL4 がマウスでは生物学的活性を示さないことです。したがって、我々は、IL4m-aNPを生成するための脂質との配合用に、ヒトapoA1とマウスIL4からなるキメラ融合タンパク質を設計および作製した。ここで我々は、IL4m-aNP がマウスの LPS 誘発寛容を逆転できるかどうかを調査しました。そのために、C57B/6 マウスに LPS (0.1 mg kg-1) を腹腔内注射して免疫麻痺または PBS (対照として) を誘導しました。 LPS 治療の 24 時間後および 48 時間後に、IL4m-aNP (1 回あたり 200 μg) を静脈内投与しました。最初の攻撃から72時間後に、マウスにLPS（0.1 mg kg-1）の別の腹腔内注射を再攻撃しました（図6d）。効果の大きさの制約にもかかわらず、IL4m-aNPでの治療は、寛容化マウスのLPS再攻撃後の血清IL6濃度の統計的に有意な（P = 0.0079）増加によって示されるように、自然免疫応答を改善しました（図6e）。一部のマウスのTNF濃度も明らかに上昇しましたが、治療反応の不均一性により統計的有意性は達成されませんでした（P = 0.1508）（図6e）。まとめると、我々の in vitro および in vivo データは、IL4-aNP 免疫療法が耐性を低下させる可能性があることを示しています。

マウスモデルで耐性の逆転を観察した後、ヒトの臨床免疫麻痺をより厳密に模倣したモデルでこれらの結果を実証しました。我々は、敗血症の高炎症性表現型と免疫麻痺性表現型の両方の特徴を捕捉する全身性炎症の標準化された制御モデルである、実験的ヒト内毒素血症を患っている健康な個人から血液を入手した（図6f）。この対照ヒトモデルでは、LPS が健康なボランティアに静脈内投与され、全身性炎症反応が引き起こされ、その後循環単球の寛容化が引き起こされます。この現象は敗血症誘発免疫麻痺でも観察されます。 LPS投与の開始前および開始4時間後に血液を採取した。 LPS投与後に単離された単球は、LPSへの即時再曝露時にサイトカイン産生の欠如を示し、寛容化を示しました（拡張データ図6b）。 LPSにチャレンジしたボランティアの寛容単球をex vivoでIL4またはIL4-aNPのいずれかに24時間曝露すると、3日目にLPSで再刺激するとTNFの産生の大幅な改善が示されましたが、IL6の産生はそうではありませんでした（図6g） (濃度) および 6h (変化倍数) および拡張データ図 6c)。対照的に、未処理の単球は完全に耐性のままでした。これらのデータを総合すると、IL4 および IL4-aNP が ex vivo で LPS 耐性を少なくとも部分的に逆転させる能力を強調しています。

IL4 は一般に抗炎症性サイトカインであると考えられていますが、単球およびマクロファージの機能に対する長期的な影響は不明です 15、24、25、26。我々は当初、IL4がIL37およびIL38と同様に訓練された免疫を阻害すると予想した（参考文献27、28。急性炎症に対する既知の阻害効果に加えて、サイトカイン産生反応性の増加によって評価されるように、IL4が訓練された免疫を誘導することを観察した。 IL4 による訓練された免疫の誘導は予想外でしたが、私たちの観察は、訓練された免疫の中心的なメカニズムである IL4 による mTOR シグナル伝達カスケードの活性化と一致しています 10,29。これに関連して、結果は、IL4 への細胞の急性曝露中は抗炎症性 STAT6 依存性細胞プログラムが優勢であるが、これが時間の経過とともに mTOR 駆動型のプログラムに移行することを示しています。 IL4 トレーニングは、サイトカイン産生の増強、エピジェネティックな再配線、代謝活性の増加、再刺激時のトランスクリプトーム応答の変化など、通常は訓練された免疫に起因する特性を示します。これらの観察は、参考文献で提案されているような単球分化の動的およびタイミング依存モデルに関する証拠の増加と一致しています。 30.

宿主防御を改善すると報告されている、訓練された免疫プログラムを誘導しながら急性炎症を同時に抑制するIL4の能力10は、重篤な感染症の治療に利用できる可能性があります。例えば、敗血症と2019年のコロナウイルス感染症（参考文献31）は両方とも免疫応答の調節不全を特徴とし、過剰炎症反応の管理と（日和見）二次感染に対する宿主防御反応の改善の両方を必要とする治療上のパラドックスを生み出している。 IL4 のこれらの特徴を利用するために、我々はナノ粒子タンパク質工学戦略を開発し、それによってこのサイトカインの不利な in vivo 薬物動態特性を克服しました。したがって、我々は、キメラ融合タンパク質の場合と同様にタンパク質と発現系を最適化することで将来の研究で改善できる特徴である融合タンパク質のIL4効力の低下を、大幅に改善されたバイオアベイラビリティと薬物動態の利益と引き換えにします。我々は、以前にモデルで観察されたように、aNP戦略がIL4の血中半減期と生体内分布プロファイルを有利に変化させ、その結果、骨髄や脾臓などの骨髄細胞が豊富な臓器における好中球特異的および単球特異的な蓄積の増加をもたらすことを示す。訓練された免疫力32。さらに、これらの研究は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）、コレステロール、およびapoA1からなるaNPが訓練された免疫を誘導しないことを示しており、我々の発見がIL4の生物学的効果に厳密に関連していることを強調しています（参考文献33)。我々は、ヒト apoA1-IL4 を含む aNP の生体内分布を研究する一方で、in vivo での有効性を評価するためにマウス変異体 IL4m-aNP をさらに開発しました。実際、我々は、IL4m-aNPがLPS誘発性敗血症マウスモデルにおいて免疫麻痺を部分的に回復できることを示す。データは、IL6産生の大幅な増加とIL4m-aNPで治療したマウスの血清中のTNF濃度の増加傾向を伴う自然免疫応答の回復を示していますが、可能性を拡大するには本格的な用量範囲決定研究が必要です。同時の過剰炎症と免疫麻痺を特徴とする一連の免疫介在性疾患におけるIL4-aNP療法の研究。ヒト融合タンパク質を使用して、IL4-aNP が臨床免疫麻痺を模倣するヒトモデルから取得した細胞の免疫寛容を逆転できることを示したことは心強いことです。

我々は、サイトカインナノ粒子技術が他の骨髄系用途にも応用できる可能性があると期待しています。免疫麻痺の状態は敗血症に特有のものではありません。がんは局所的な前腫瘍炎症と抗腫瘍反応（骨髄細胞によって媒介されることが多い）の同時抑制も特徴とするため、免疫腫瘍学的応用が検討される可能性があります34。心筋梗塞や脳卒中も、無菌炎症とそれに続く免疫麻痺を特徴とし 35,36、重度の外傷を負った患者は同様の免疫麻痺状態に苦しんでいます 37。これらすべての状況において、炎症を軽減し、免疫麻痺を克服することは、患者の回復と二次感染の防止に有益である可能性があります。 IL4-aNP テクノロジーは、これらすべての症状を治療するための治療法として開発される可能性があります。

書面によるインフォームドコンセントを得た後に、健康なボランティアからバフィーコート（Sanquin）またはEDTA全血を採取しました。この材料を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）で少なくとも１：１に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）の上に層にした。 615 g で 30 分間の密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核球 (PBMC) 間期を分離しました。冷PBSで3〜5回洗浄した後、血液分析装置(XN-450; Sysmex)を使用してPBMCの収量および組成を評価した。

ネガティブに選択された単球は、製造業者の指示に従ってMACSを使用して得られた(MACS Pan単球単離キット、ヒト; Miltenyi Biotec)。単球の収量と純度は、Sysmex 血液分析装置で評価されました。

いくつかの実験（本文に示されている）では、代わりに、Percoll (Sigma-Aldrich) での高浸透圧密度勾配遠心分離によって PBMC から単球を濃縮しました。約 150 ～ 200 × 106 個の PBMC を高浸透圧 Percoll 溶液 (48.5% v/v Percoll、0.16 M NaCl、滅菌水中) の上に層にし、580 g、室温 (RT) で 15 分間遠心分離しました。界面を収集し、冷PBSで1回洗浄し、RPMIに再懸濁した。

すべての初代ヒト単球およびマクロファージを、GlutaMAX (2 mM; GIBCO)、ピルビン酸ナトリウム (1 mM; GIBCO) およびゲンタマイシン (50 μg ml-1; Centrafarm) をさらに補充したオランダ改変 RPMI-1640 (Invitrogen) で培養しました。。この媒体はさらに、RPMI+++ とも呼ばれます。さらに、細胞培養中に 10% (v/v) ヒトプール血清を培地に添加しました (「細胞培養培地」とも呼ばれます)。

初代ヒト単球で訓練された免疫を誘導するために、以前に最適化され公開された方法が使用されました 38,39。簡単に説明すると、単球を平底細胞培養プレートに 1 時間接着させ、温 PBS で洗浄して非接着細胞および細胞破片を除去しました。次に、補足表 1 に詳述されている刺激の 1 つ、または培地のみ (「未訓練」コントロール) で 24 時間刺激しました (「訓練」)。

薬理学的阻害実験では、トレーニング刺激を加える前に、補足表 2 に記載されている阻害剤の 1 つとともに単球を 1 時間プレインキュベートしました。

最初の 24 時間の刺激後、細胞を温 PBS で洗浄し、温細胞培養培地を添加しました。その後、単球を 5 日間休ませてマクロファージに分化させました。 6日目に、訓練された免疫の誘導を評価しました。この目的を達成するために、通常、サイトカイン産生を誘発するために細胞をさらに 24 時間 LPS で再刺激しました。上清を収集し、さらなる分析まで -20 °C で保存しました。

他のほとんどの訓練済み免疫読み出し方法では、細胞は次のように収集されました。まず、細胞を細胞培養インキュベーター内で Versene 細胞解離試薬 (Life Technologies) 中で 30 分間インキュベートしました。次いで、セルスクレーパーを使用して、培養プレートから細胞を除去した。収量を最大化するために、氷冷した PBS を添加した後、培養プレートを 2 回こすり落としました。マクロファージを 300 g、4 °C で 10 分間遠心分離し、下流への適用を続ける前に計数しました。

moDC をマクロファージ (未訓練のコントロールまたは IL4 訓練) と比較する実験では、moDC を次のように区別しました。まず、ネガティブに選択された単球を上記のように取得した。 1時間の接着およびPBS洗浄後、IL4（25 ng ml-1）およびGM-CSF（1,000 IU ml-1;プレミアムグレード、Miltenyi Biotec）をさらに補充した10% HPSを含むRPMI+++で培養しました。細胞を６日目まで分化させ、３日目に培地を１回交換した。６日目に、付着細胞に加えて非付着細胞を収集した（上記の通り）。次いで、ｍｏＤＣおよびマクロファージを、以下に記載するようにフローサイトメトリーによる分析に供した。

18歳から35歳までの健康な（病歴、身体検査、定期的な臨床検査で確認された）男性ボランティア8名が、ラドバウド病院の集中治療部の研究室で行われた内毒素血症の実験実験に参加するための書面によるインフォームドコンセントを提供した。大学医療センター。すべての研究手順は地元の倫理委員会（CMO Arnhem-Nijmegen (Radboudumc)、登録番号 NL71293.091.19 および 2019-5730）によって承認され、ヘルシンキ宣言の最新版に従って実施されました。

他の場所で詳細に説明されているように、持続的なエンドトキシン注入レジメンが使用されました40。つまり、参加者は研究ユニットに入院し、前肘静脈と橈骨動脈にカニューレが挿入され、それぞれ液体とエンドトキシンの投与、採血と血行動態のモニタリングが可能となった。実験中、3 誘導 ECG を継続的に記録しました。等浸透圧の事前水和（エンドトキシン注入開始の1時間前に1.5 lのNaCl 0.45%およびグルコース2.5%を静脈内投与）後、ボランティアに負荷用量の1 ng kg-1体重のエンドトキシン（大腸菌リポ多糖）を静脈内投与した。 (LPS) タイプ O113、ロット番号 94332B1; List Biological Laboratories)、その後 0.5 ng kg-1 h-1 を 3 時間連続注入します。参加者はエンドトキシン負荷投与後8時間モニタリングされ、その後研究ユニットから退院した。

このプロジェクトでは、負荷用量の投与の 1 時間前と 4 時間後の 2 つの時点で血液サンプルを採取しました。ネガティブに選択された単球を上記のように取得した。細胞を接着させ、組換えヒトIL4、円盤状IL4-aNP、LPS（初期免疫寛容を評価するため）または培地のみ（対照として）で24時間刺激した。 PBSで洗浄した後、細胞を培地中で48時間静置し、さらに24時間LPSで再刺激しました。上清を収集し、-20 °C で保存しました。

ＴＮＦ、ＩＬ６およびＩＬ１Ｒａは、デュオセットＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の指示に従って使用して、細胞培養上清中で測定した。乳酸塩の測定には、蛍光分析アッセイが使用されました。約30μlのサンプル、培地コントロール、または既知の標準を黒色の96ウェルプレートに加えました。次に、30 μl の反応混合物 (PBS pH 7.4、ホースラディッシュペルオキシダーゼ (0.2 U ml-1)、乳酸オキシダーゼ (2 U ml-1)、アンプレックスレッド (100 μM; Fisher Scientific)) を加え、反応混合物を室温の暗所で２０分間インキュベートした。その直後に、530/25nmおよび590/35nmで蛍光を測定した。 Gen5 ソフトウェア (v3.03、BioTek) を Microsoft Excel と組み合わせて使用し、元のサンプル中のサイトカインおよび乳酸濃度を計算しました。

マクロファージを上記のように収集し、染色のために V 底 96 ウェルプレートに移しました。細胞を4℃、400gで5分間遠心分離しました。上清を除去し、細胞を２００μｌのＰＢＡ（ＰＢＳｐＨ７．４、１％ｗ／ｖＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ））で１回洗浄した。

Fc受容体は、10%ヒトプール血清を補充したPBS中で4℃で15分間インキュベートすることによりブロックした。もう一度洗浄した後、補足表3に記載されている抗体と生存率色素を使用して、表面マーカーと生存率を50μlの容量で4℃で30分間染色しました。 2回洗浄した後、細胞を150μlに再懸濁しました。 PBA を測定し、Cytoflex フローサイトメーター (Beckman Coulter) または BD FACSVerse システム (BD Biosciences) で測定しました。単一抗体染色については、VersaComp 補正ビーズ (Beckman Coulter) を使用して補正を実行しました。生細胞と熱死細胞の混合物を、生存率色素の単一染色に使用しました (メーカーの推奨に従って)。データ分析は Flowjo (v10.7.1、BD Biosciences) で実行されました。ゲーティング戦略は次のとおりです。まず、必要に応じてタイムゲートを使用しました。次に、後続の FSC-A/SSC-A および FSC-A/FSC-H ゲートを使用して単一細胞イベントを選択しました。死細胞は、生存率色素陰性集団を選択することによって分析から除去されました。幾何平均蛍光強度を表面マーカー発現の尺度として計算した。

混合リンパ球反応実験では、収集したマクロファージをその後の T 細胞分極アッセイに使用しました。同種異系ナイーブ T 細胞に、マクロファージごとに 10 T 細胞の比率でマクロファージを播種しました。細胞を平底96ウェルプレートで標準的な細胞培養培地中で7日間培養しました。このモデルでは、ヒト白血球抗原の不一致により、T 細胞受容体の非特異的活性化が引き起こされます。最終日に、100 ng ml-1 のブレフェルジン A の存在下で、細胞をホルボール 12-ミリステート 13-アセテート (25 ng ml-1) + イオノマイシン (0.5 μg ml-1) で 4 時間刺激しました。ゴルジプラグ」。細胞を収集し、2 つのフローサイトメトリー抗体パネル (CD4 T 細胞用と CD8 用 1 つ; 補足表 3 も参照) に分割しました。細胞は、細胞内サイトカイン染色を可能にするために T 細胞の透過処理のための追加のステップを加えて、上記と同様の方法で染色されました。これは、製造元の指示に従って、修正およびパーマバッファセット (eBioscience) を使用して実行されました。ゲート戦略は上記のものと同様でしたが、CD3 陽性イベントの選択が追加されました。 T 細胞分極の特徴的なサイトカインに対して陽性の細胞の割合を計算して、T 細胞サブセットの割合を推定しました。

単球を、RPMI、IL4、またはさまざまな濃度のIL4-aNP（拡張データ図6aに示す）で37℃で20分間刺激しました。細胞をV底96ウェルプレートに移し、染色手順の間氷上に保持した。生存率およびCD14を染色した後（上記の方法で）、固定およびパーマ緩衝液セット（eBioscience）を使用して、暗所で4℃で45分間、細胞を固定し、透過処理した。細胞をパーマバッファーで2回洗浄し、冷凍庫で冷却した無水メタノール中で-20℃で一晩インキュベートしました。パーマバッファーでさらに2回洗浄した後、補足表3に記載の抗体を使用して、暗所、4℃で45分間、細胞をホスホSTAT6について染色した。細胞をパーマ緩衝液でさらに２回洗浄し、最後にＣｙｔｏｆｌｅｘサイトメーターで取得するためにＰＢＡに再懸濁した。ゲーティング戦略は、マクロファージ表面マーカーのゲーティング戦略とほぼ同様でしたが、CD14 陽性イベントの選択が追加されました。

マクロファージを上記のように収集し、FITC標識C. albicans（M. Jaeger, Radboudumcのご厚意により提供）とともに1:5のMOIで37℃で1時間インキュベートしました。細胞を氷冷したＰＢＡで２回洗浄し、食作用を停止させるために氷上に保持した。細胞は、4℃の暗所で30分間CD45について染色されました（補足表3）。 2回の洗浄後、トリパンブルーを最終濃度0.01%で添加して、細胞外FITC-カンジダを消光させた。次いで、細胞をCytoflexフローサイトメーターで取得した。

データ分析中に、カンジダのみのイベントを除去するために、CD45+ イベントが最初に選択されました。次いで、単一細胞を上記のようにゲートオンし、各サンプル中のカンジダ-FITC陽性マクロファージの割合を計算した。

マクロファージを上記のように収集した。細胞をRPMI+++に再懸濁し、一晩校正したカートリッジにウェルあたり105細胞で播種しました。 1 時間接着した後、培地をアッセイ培地 (Agilent、下記参照) に交換し、細胞を周囲 CO2 レベル、37 °C で 1 時間インキュベートしました。 Seahorse XF 解糖ストレステストキットまたは Seahorse XF Cell Mito ストレステストキットを使用して、解糖代謝およびミトコンドリア代謝の代用として、酸素消費速度と細胞外酸性化速度を測定しました (どちらも Agilent、測定は製造元の指示に従って実行)。

単球またはマクロファージをRLT緩衝液（Qiagen）中で溶解し、-80℃で保存した。 RNA 抽出は、オンカラム DNAse I 処理 (RNase フリー; Qiagen) を備えた RNeasy ミニカラム (Qiagen) を使用して実行されました。予備的な品質管理と濃度の測定は、Nanodrop 装置を使用して実行されました。サンプルは、DNBseq プラットフォームを使用した RNA シーケンスのために北京ゲノム研究所 (BGI デンマーク) に送られました。

遺伝子発現レベルを推測するために、Bowtie (v1.2)41 を使用して、RNA シークエンシングリードを hg19 ヒトトランスクリプトームとアライメントしました。 RPKM としての遺伝子発現レベルの定量化は、MMSEQ (v1.0.10)42 を使用して実行されました。リードと転写物は DEseq2 を使用して正規化し、ペアワイズ比較を実行しました。差次的に発現される遺伝子は、DEseq2 (v1.34.0) を使用して倍数変化 > 2 および P < 0.05、平均 RPKM > 1 で同定されました (参考文献 43)。 IL4 トレーニングによって上方制御または減弱された遺伝子を特定するために、RPMI-d6 および IL4-d6 マクロファージをそれぞれ RPMI-d6+LPS および IL4-d6+LPS サンプルと比較しました。遺伝子リストは、IL4-d6+LPS/RPMI-d6+LPSに基づいてマージされ、ランク付けされました。遺伝子オントロジーおよび TF モチーフ分析は、HOMER findMotifs ツール (v4.11)44 を使用して遺伝子プロモーターに対して実行されました。

マクロファージを上記のように収集し、RPMI+++に再懸濁した。細胞を 1% メタノールを含まないホルムアルデヒド中で 10 分間固定しました。次いで、１２５ｍＭのグリシンを添加することによって反応を３分間停止させた。固定細胞を氷冷 PBS で 3 回洗浄し、溶解バッファー (20 mM HEPES pH 7.6、1% SDS、1× プロテアーゼ阻害剤カクテル (Roche)) 中で 1 ml あたり約 15 × 106 細胞で溶解し、超音波処理 (Bioruptor Pico) しました。、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を使用し、遠心分離した（１０分間、１６，０６０ｇ、室温）。

クロマチンのアリコートを 0.5 × TBE 緩衝液 (0.5 mg ml-1 プロテイナーゼ K (Qiagen) を添加) 中で 65 °C で 1 時間脱架橋し、1% アガロースゲルで泳動して、標的断片サイズが 200 ～ 800 であることを確認しました。血圧。

残りのクロマチンを ChIP サンプルとインプットサンプルに分割しました。 ChIP サンプルを希釈バッファー (16.7 mM Tris pH 8.0、1.0% Triton、1.2 mM EDTA、167 mM NaCl、Milli-Q 中の 1 × プロテアーゼ阻害剤カクテル) および 1 μg の ChIP グレード抗体 (Diagenode) で 10 倍に希釈しました。が追加されました。サンプルを 4 °C で一晩回転させました。

磁性プロテインA/Gビーズ(Dynabeads)を、0.15% SDSおよび0.1% BSAを補充した希釈緩衝液で2回洗浄した。洗浄したビーズを ChIP サンプルに加え、4 °C で 1 時間回転させました。続いて、ビーズに結合したクロマチンを以下のように洗浄しました（5分間回転、4℃）：低塩洗浄緩衝液（20 mM Tris pH 8.0、1.0% Triton、0.1% SDS、2 mM EDTA、150 mM NaCl）で1回Milli-Q 溶液）、高塩洗浄バッファー（低塩洗浄バッファーと同じですが、500 mM NaCl を使用）で 2 回、無塩洗浄バッファー（20 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、Milli 溶液）で 2 回-Q)。クロマチンを、室温で２０分間、溶出緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ３、１％ＳＤＳ、ミリＱ中）中でビーズから溶出した。入力サンプルを溶出バッファーで 12 倍に希釈しました。 NaCl (0.2 M) およびプロテイナーゼ K (0.1 mg ml-1) を添加した後、すべてのサンプルを振盪ヒートブロック (65 °C、1,000 rpm) 上で少なくとも 4 時間脱架橋しました。 MinElute PCR精製カラム(Qiagen)を使用してDNA断片を精製した。 DNA フラグメントは、qPCR による下流の分析まで 4 °C で保存されました。

ChIP サンプルとインプットの qPCR 分析は次のように実行されました。 SYBR グリーン法を使用して、補足表 4 に詳述するプライマーを使用して qPCR を実行しました。比較 Ct 法を使用して、ChIP を入力サンプルと比較し、ネガティブコントロール領域にわたる相対存在量を計算しました。 GAPDH および ZNF の非翻訳領域は、それぞれ H3K9me3 の陰性および陽性対照として使用されました。以前に記載されているように、AUC 分析用の 6 つのプライマーペアを使用して TNF を調査しました 45。

ClearColi BL21 (DE3) (Lucigen) を pET20b(+)apoA1-IL4 発現ベクターで形質転換しました。形質転換した細菌を、100μg l-1のアンピシリンを補充した40mlの溶原性ブロス(Sigma-Aldrich)に接種し、37℃で一晩増殖させた。続いて、一晩培養物を、100μg l-1アンピシリンを補充した2YT培地（16g l-1ペプトン、10g l-1酵母エキスおよび10g l-1NaCl）に植菌し、37℃で増殖させた。 600 nm での吸光度が >1.5 に達した時点で、1.0 mM イソプロピル β-d-チオガラコピラノシドを添加して pET20b(+) apoA1-IL4 発現を誘導し、細胞を 20 °C で一晩インキュベートしました。溶解物の調製および精製の前に、細胞を遠心分離によって収集した。

ClearColi 細胞を発現する ApoA1-IL4 融合タンパク質を、10,880 g、4 °C で 10 分間遠心分離することによって収集しました。収集した細胞を PBS に再懸濁し、3,500 g、4 °C で 15 分間遠心分離しました。細胞を、室温で３０分間、シェーカー上で培養物１リットル当たり２０ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（Ｍｅｒｃｋ）および２０μｌのベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を使用して溶解した。細胞溶解物を 39,000 g、4 °C で 30 分間遠心分離しました。不溶性ペレットを1リットル当たり10mlのBugBusterで洗浄し、39,000g、4℃で20分間遠心分離した。封入体を含むペレットを抽出緩衝液(6M塩酸グアニジン、50mMリン酸カリウムおよび1mM還元グルタチオン)に再懸濁し、振盪機上でRTで15分間インキュベートした。懸濁液を39,000 g、4℃で30分間遠心分離して、不溶性画分を除去した。濾過した可溶性画分をニッケルカラムにロードし、15カラム容量のIMAC洗浄緩衝液で洗浄した。 ApoA1-IL4は、リフォールディングバッファー60ml（7M尿素、1mM還元グルタチオン、0.1mM酸化グルタチオン、50mMリン酸カリウムおよび100mM NaCl pH6.8）からリフォールディングバッファー60mlまでの直線勾配アンフォールディングバッファーを使用して、ニッケルカラム上でアンフォールディングおよびリフォールディングされました。 (1 mM 還元グルタチオン、0.1 mM 酸化グルタチオン、50 mM リン酸カリウムおよび 100 mM NaCl pH 6.8) 2.5 ml min-1。リフォールディングされた apoA1-IL4 を、pH 7.9 の 0.5 M イミダゾール、20 mM Tris および 0.5 M NaCl を使用してカラムから溶出しました。溶出液を収集し、濃縮し、さらに精製し、PBS保存緩衝液で平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー(HiLoad 16/600 Superdex 75 Increase; GE Healthcare)によって緩衝液交換した。画分を SDS-PAGE で分析し、プールして濃縮し、液体窒素中で瞬間凍結してから -80 °C で保存しました。 ApoA1-IL4 の質量は、MS 用 MagTran V1.03 を使用して、Q-ToF LC-MS (WatersMassLynx v4.1) によって確認されました。

HEK293T 細胞を、Opti-MEM (GIBCO) 中のトランスファーベクター pHR-apoA1–IL4m、パッケージング pCMVR8.74 およびエンベロープ pMD2.G を含む fuGENE (Promega) で 37 °C で 24 時間コトランスフェクトしました。細胞を、2%の熱不活化FBSを添加したDMEMで洗浄し、48時間インキュベートした。 pHR-apoA1-IL4m を含むレンチウイルスを得るために、上清を 875 g で遠心分離して細胞破片を除去し、0.45 μm PES シリンジフィルターで濾過し、50,000 g で 2 時間、4 °C で遠心分離しました。 pHR-apoA1-IL4m レンチウイルスを含むペレットを培地に再懸濁し、液体窒素で瞬間凍結し、-80 °C で選別しました。 HEK293F 細胞に、トランスフェクション培地 (DMEM、10% HI FBS、1× ポリブレン (Sigma-Aldrich)) 中でレンチウイルスを含む pHR-apoA1–IL4m を用いて 24 時間形質導入しました。その後、細胞を発現培地 (50% EX-CELL 293) で培養しました。 HEK293 細胞用無血清培地 (Merck) および 50% FreeStyle 293 Expression Medium (Thermo Fisher Scientific)、Glutamax、1% Pen-Strep および 1 μg ml-1 ドキシサイクリン (Merck) を添加し、シェーカー上で 150 rpm で 3 分間培養します。 apoA1-IL4m を含む培養上清を 3,500 g、4 °C で 15 分間遠心分離し、0.22 µm PES シリンジフィルターで濾過して細胞残骸を除去し、濾過した可溶性画分を StrepTactin XT 4flow 5 ml カラムにロードしました。 (Cytiva) で洗浄し、5 カラム容量の W バッファー (150 mM NaCl、100 mM Tris、1 mM EDTA pH 8) で流速 1 ～ 2 ml min-1 で洗浄しました。ApoA1 – IL4m は W バッファーでカラムから溶出しました。 50 mM ビオチンを添加. 溶出液を収集し、濃縮し、-80 °C で保存する前に液体窒素中で瞬間凍結しました. ApoA1 – IL4m の質量は、MagTran V1 を使用した Q-ToF LC-MS (WatersMassLynx v4.1) によって確認されました。 MSの場合は03。

apoA1 と IL4 の融合を確認するために、100 ng IL4 (BioLegend)、apoA1 および apoA1-IL4 を 4-20% ポリアクリルアミドゲル (Bio-Rad) にロードしました。ゲル電気泳動後、サンプルをブロット緩衝液（10×TG緩衝液、20％メタノール）を用いてニトロセルロース膜に移した。続いて、膜をブロッキング緩衝液（PBS中5％ミルク、0.1％トゥイーン（PBST））とともに4℃で一晩インキュベートした。ブロットを一次モノクローナル抗体モノクローナル抗 IL4 (HIL41、1:200; sc-12723、Santa Cruz Biotechnology) および抗 apoA1 (B10、1:100; sc-376818、Santa Cruz Biotechnology) とともに 1 時間インキュベートしました。 4℃。一次抗体とインキュベートした後、メンブレンを洗浄し、ウサギ抗マウス IgG (H+L)-HRP コンジュゲート (1:5,000、31457、Pierce) とインキュベートしました。 HRP 結合二次抗体は TMB (Thermo Fisher Scientific) で検出され、Image Quant ゲルイメージャー (GE Healthcare) を使用して視覚化されました。

SPR測定は、Biacore ×100 SPRシステム(GE Healthcare)を使用して実施した。ヒトIL4受容体α-FCキメラ（Biolegend）をプロテインGセンサーチップ（GE Healthcare）上に固定化した。 Log2 希釈濃度シリーズは、200 nM ～ 6.25 nM の範囲の apoA1 ～ IL4、および 20 nM ～ 0.65 nM の範囲のヒト IL4 で構成されました。全てのサンプルは、ＨＰＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で調製された。流速 30 μl min-1 で結合を 180 秒間、解離を 180 秒間監視しました。センサーチップはグリシン 1.5 (10 mM グリシン-HCl pH 1.5、GE Healthcare) で再生されました。反応速度は、相互作用 SPR データを 1:1 結合に当てはめることによって決定されました。

HEK-Blue IL4/IL13 細胞は InvivoGen から購入しました。この細胞株は完全に活性化された STAT6 経路を有し、STAT6 誘導性 SEAP レポーター遺伝子を保有しています。 HEK-Blue IL4/IL13 細胞は、IL4 および IL13 に応答して SEAP を産生します。分泌された SEAP のレベルは、QUANTI-Blue (InvivoGen) で測定できます。 5 × 104 細胞を含む 10% FBS および 1% Pen-Strep を含む約 180 μl の DMEM を、96 ウェルプレートのウェルごとに加えました。続いて、20 μl の刺激物またはビヒクルを添加し、細胞を 37 °C で 20 ～ 24 時間インキュベートしました。続いて、180μlのQUANTI-Blueを別の96ウェルプレート(平底)にウェルごとに加え、20μlの細胞上清を加えた。プレートを 37 °C で 1 ～ 3 時間インキュベートし、Tecan Spark プレートリーダーで 640 nm の吸光度を測定して SEAP レベルを測定しました。

すべてのリン脂質は Avanti Polar Lipids から購入しました。 4 つの異なる aNP が製剤化されました。クロロホルム、DMPC (133.5 μl)、およびコレステロール (Sigma-Aldrich) (7.5 μl) 中のストック溶液 (10 mg ml-1) からの円盤状 aNP の場合、および球状 aNP の場合は、POPC (66.5 μl)、PHPC (17.5 μl)、コレステロール（4.5μl）およびトリカプリリン（Sigma-Aldrich）（0.956g ml-1ストックから2.79μl）をガラスバイアル中で混合し、真空下で乾燥させた。得られたフィルムをアセトニトリルとメタノールの混合物(95:5%、総量800μl)に再溶解した。 apoA1に基づく製剤では、コレステロール(15μl)を使用した。別に、apoA1 タンパク質の PBS 溶液 (6 ml、0.1 mg ml-1)、apoA1-IL4 タンパク質の PBS 溶液 (6 ml、0.17 mg ml-1)、または apoA1-IL4m の PBS 溶液 (6 ml、0.18 mg ml-1) １）を用意しました。

マイクロ流体ポンプフュージョン 100 (Chemyx) を使用して、両方の溶液を同時に Zeonor ヘリンボーンミキサー (Microfluidic Chipshop、製品コード 10000076) に脂質溶液の流量 0.75 ml min-1、流量 6 ml min-1 で注入しました。 apoA1 ソリューションの場合。得られた溶液を、円盤状の１０ｋＤａＭＷＣＯおよび球状ａＮＰの１００ｋＤａＭＷＣＯのいずれかのＶｉｖａｓｐｉｎチューブを３，５００ｇで使用して遠心濾過により濃縮し、１ｍｌの体積を得た。ＰＢＳ（５ｍｌ）を加え、溶液を５ｍｌまで濃縮した。これを2回繰り返した。洗浄した溶液を約１．５ｍｌまで濃縮し、０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターを通して濾過して、完成したａＮＰを得た。 aNP サンプル中のタンパク質濃度は、Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) を使用して定量しました。蛍光 aNP を製剤化するには、0.5 mg の DiOC18(3) 色素 (DiO) (Thermo Fisher Scientific) を、脂質フィルムの調製に使用したクロロホルム溶液に溶解しました。

ＰＢＳ中で得られたａＮＰ製剤を０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターを通して濾過し、ＭａｌｖｅｒｎＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ分析装置上のＤＬＳによって分析した。値は平均数平均サイズ分布として報告されます。

IL4、apoA1–IL4、およびIL4-aNPを2モル過剰のDFO-p-NCS（DMSO中5 mg ml-1）とともに2時間インキュベートし、10 kDa MWCO Vivaspinチューブを使用して3回洗浄して未反応のDFO-pを除去しました。 -NCS。放射性標識のために、DFO 結合タンパク質と aNP を 89Zr と 89Zr と 37 °C で、サーモミキサーを使用して 600 rpm で 1 時間インキュベートし、10 kDa MWCO Vivaspin チューブを使用して 3 回洗浄して未反応の 89Zr を除去しました。

まず、Cressington 208 カーボンコーターを使用して、200 メッシュのレース状カーボン担持銅グリッド (Electron Microscopy Sciences) の表面を 40 秒間プラズマ処理しました。続いて、3 ml の IL4-aNPs サンプル (1 ml あたりタンパク質約 1 mg) をグリッド上に適用し、自動ロボット (FEI Vitrobot Mark IV) を使用して液体エタン中でプランジガラス化することにより薄膜にガラス化しました。 Cryo-TEM イメージングは、電界放出銃、ポストカラム Gatan イメージングフィルター (モデル 2002)、およびポスト GIF 2k × 2k Gatan CCD カメラ (モデル 794) を備えた cryoTITAN (Thermo Fisher Scientific) で実行されました。画像は、6,500 倍 (線量率 1.64 電子 A-2 s-1) または 24,000 倍 (線量率 11.8 電子 A-2 s-1) のいずれかで、明視野 TEM モードで加速電圧 300 kV で損失ゼロのエネルギーフィルターを使用して取得されました。 s−1) および 1 秒の取得時間。

ヒト単球は、上記のように健康なドナーの末梢血から単離されました。細胞培養処理したチャンバー付きカバースリップ (μ-Slide 8 ウェル、IBID) 上のウェルごとに約 100,000 個の単球を播種しました。 37 °C で 2 時間インキュベートした後 (細胞付着)、細胞を、裸の apoA1 または apoA1-IL4、円盤状 aNP または IL4-aNP、および球状 aNP またはIL4-aNP。続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで２０分間固定した。 IL4 受容体をポリクローナルウサギ IgG1 抗ヒト IL4R (Thermo Fisher Scientific; 1:100 希釈) 一次抗体で 4 °C で 24 時間染色し、続いてヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488 結合二次抗体 (Thermo Fischer) で染色しました。科学的; 希釈 1:500) 室温で 1 時間。染色された細胞は、PBS 中で 4 °C で保存されました。 dSTORMの場合、イメージング前およびイメージング中に細胞をGLOXYイメージングバッファー（PBS中40μg ml-1カタラーゼ、0.5mg ml-1グルコースオキシダーゼ、5％グルコースおよび0.01Mシステアミン、pH8.0）に浸漬しました。。取得は、ONI Nanoimager (ONI) を使用して全反射蛍光モードで実行されました。 100×/1.4NA 油浸対物レンズと sCMOS カメラが装備されており、この研究では 488 nm (200 mW) と 640 nm (1000 mW) のレーザーが使用されました。 50 × 80 µm の視野で 10 ms の露光時間で約 10,000 フレームが取得されました。生データは ThunderSTORM ソフトウェア (v1.3)46,47 を使用して処理され、空間解像度 10 nm の画像が得られました。

雌の C57BL/6 J マウス (約 8 ～ 11 週齢、約 20 g) を Charles River Germany から購入しました。ヒト以外の霊長類の研究には、15 歳と 16 歳の 2 頭の雄のカニクイザル (Macaca fascicularis) が使用されました。すべての動物は、それぞれ 20 ～ 24 °C、湿度 45 ～ 65%、明暗サイクル 12 時間の気候制御された条件で共同飼育され、水を自由に与えられました。マウスには標準的な固形飼料を与え、ヒト以外の霊長類には Teklad Global 20% Protein Primate Diet を与えました。動物の管理および実験手順は、マウントサイナイのアイカーン医科大学から承認された施設プロトコルに基づいていました。すべてのマウスを実験グループにランダムに割り当てました。

C57BL/6 マウスに、89Zr 標識 IL4 バリアント、IL4 (53.6 ± 6.6 μCi)、apoA1-IL4 (30.1 ± 0.9 μCi)、円盤状 IL4-aNP (146.1 ± 46.5 μCi)、および球状 IL4-aNP ( 108.6 ± 16.9 μCi)。 2 匹の非ヒト霊長類に、円盤状の 89Zr 標識 IL4-aNP (1079 μCi および 682 μCi) を注射しました。所定の時点（マウスの場合は 1、2、5、10、30 分、1、2、4、8、24 時間、ヒト以外の霊長類の場合は 5、30、90 分、48 時間）で、注射後、血液を採取し、重量を量り、Wizard2 2480自動ガンマカウンター（Perkin Elmer）を使用して放射能を測定した。データは放射性崩壊について補正され、血液 1 グラムあたりの注射用量のパーセンテージ (1 g あたりの %ID) が計算されました。データは、GraphPad Prism の非線形二相減衰回帰を使用してフィッティングされ、加重血中半減期は式 (% fast × t1/2 fast + % low × t1/2)/100 によって計算されました。マウスの体内分布を注射の 24 時間後に測定しました。ＰＢＳ灌流後、対象の組織を収集して重量を量り、Wizard2 2480自動ガンマカウンター（Perkin Elmer）を使用して放射能を測定した。データは放射性崩壊について補正され、組織 1 グラムあたりの注入線量のパーセンテージ (1 g あたりの %ID) が計算されました。

C57BL/6 マウスに、89Zr 標識 IL4 バリアント、IL4 (53.6 ± 6.6 μCi)、apoA1-IL4 (30.1 ± 0.9 μCi)、円盤状 IL4-aNP (146.1 ± 46.5 μCi)、および球状 IL4-aNP ( 108.6 ± 16.9 μCi)。 24 時間後、O2 中の 1.0% イソフルランを流速約 1.0 l min-1 で使用してマウスを麻酔しました。 PET-CT スキャンは、Mediso nanoScan PET-CT (Mediso) を使用して取得されました。全身 CT スキャン (エネルギー、50 kVp、電流、180 μAs、等方性ボクセルサイズ、0.25 mm) を実行し、続いて 20 分間の PET スキャンを実行しました。 Mediso Nucline ソフトウェア v3.04.020.0000 の TeraTomo 3D 再構成アルゴリズムを使用して、減衰補正を使用して再構成を実行しました。偶然の一致は、400 keV と 600 keV の間のエネルギーウィンドウによって除外されました。ボクセルサイズは幅 0.4 mm の等方性で、再構成は 4 回の完全な反復 (反復ごとに 6 つのサブセット) に適用されました。

組織をフィルムカセットに入れ、ホスホイメージングプレート（BASMS-2325、Fujifilm）に対して-20℃で配置し、放射能分布を測定しました。プレートを、Typhoon 7000IP プレートリーダー (GE Healthcare) を用いて 25 mm のピクセル解像度で読み取った。

細胞特異性を高めるために、マウスに DiO 標識 IL4-aNP を静脈内注射し、24 時間循環させました。その後、マウスを屠殺し、前述のように血液、脾臓、骨髄から単細胞懸濁液を作成しました。細胞懸濁液を抗CD115、抗CD11b、抗Ly6C、抗Ly6G、抗CD19、抗CD45、抗CD11c、抗CD3および抗F4/80とともにインキュベートした。生または死んだアクアを生存率染色として使用した。続いて細胞を洗浄し、FACS緩衝液に再懸濁した。すべてのデータは、Aurora 5 l フローサイトメーター (Cytek Biosciences) で取得されました。 DiO-IL4-aNP は FITC チャネルで検出されました。

一晩絶食した後、非ヒト霊長類をケタミン（5 mg kg-1）とデクスメデトミジン（0.0075 ～ 0.015 mg kg-1）を使用して麻酔しました。非ヒト霊長類に、1.114 mCiおよび0.682 mCiの円盤状89Zr標識IL4-aNPを約0.1 mg kg-1の用量で注射した。動的 PET イメージングは注入後 60 分間実行され、追加の静的 PET-MRI スキャンは注入後 1 時間および 48 時間で実行されました。さらに、注射後 5 分、30 分、および 120 分でのイメージング中に血液を採取しました。 PET および MRI 画像は、3T PET-MRI システム (Biograph mMR、Siemens Healthineers) を使用して取得されました。 aNP の注射と同時に開始し、胸部と腹部をカバーする 1 つのベッド位置を使用して動的 PET イメージングを実行しました。 MR イメージングパラメータは次のとおりです。収集面、冠状面。繰り返し時間、1,000ミリ秒。エコー時間、79ミリ秒。スライス数、144。平均の数、4。空間解像度、0.5 × 0.5 × 1.0 mm3; 取得時間は 42 分 42 秒です。動的 PET 画像取得後、各 15 分間の 4 つの連続ベッド位置を使用して、頭蓋から骨盤までの全身の静的 PET 画像を取得しました。各ベッドと同時に、1.4 信号平均、スライス数 160、空間分解能 0.6 × 0.6 × 1.0 mm3 のみを使用したことを除き、上記のように MR 画像を取得しました（取得期間、ベッドあたり 14 分 56 秒）。全身の PET および MR イメージングも、注射の 48 時間後に、それぞれ 30 分間の 4 つの PET ベッド位置を使用して、次のような MR パラメーターで実行されました。繰り返し時間、1,000ミリ秒。エコー時間、79ミリ秒。スライス数、224。平均の数、2。空間解像度、0.6 × 0.6 × 1.0 mm3; 取得時間は 29 分 56 秒です。各ベッドからの全身 MR 画像はスキャナーによって自動的に照合されました。取得後、各ベッドからの PET 生データが再構成され、3 回の反復と 24 のサブセットに対する点広がり関数補正を備えた順序付きサブセット期待値最大化アルゴリズムを備えたシーメンス独自の e7tools を使用してオフラインで照合されました。また、画像には4mmのガウシアンフィルターを適用した。減衰には 3 コンパートメント (軟組織、肺、空気) 減衰マップが使用されました。

画像解析は、Osirix MD バージョン 11.0 を使用して実行されました。全身の MR 画像は PET 画像と融合され、冠状面で分析されました。脾臓、肝臓、腎臓、肺、心臓、小脳、大脳などの関心組織上に関心領域（ROI）を描画し、その全体を追跡し、腰椎の 3 つの椎骨を使用して骨髄の取り込みを測定しました。各 ROI について、平均標準化摂取値 (SUV) が計算されました。器官当たりの円盤状の 89Zr 標識 IL4-aNP 取り込みは、器官当たりのすべての平均 SUV 値の平均として表されました。

インビボ寛容モデルでは、11週齢の雌C57BL/6マウスに0.1 mg kg-1体重のLPSを腹腔内寛容させた。 24時間および48時間の時点で、マウスを200μgのIL4m-aNPまたはPBSのいずれかで静脈内処理した。続いて、72時間目にマウスに0.1 mg kg-1 LPSの腹腔内注射を再投与した。 90分後、マウスを屠殺し、ELISA用に血液を採取し、前述のように血液、脾臓および骨髄から単細胞懸濁液を作成した。染色プロトコルでは、ELISA 用の血液サンプルを室温で 30 分間凝固させました。 4℃、1,000gで10分間遠心分離した後、血清を採取した。マウスＴＮＦおよびＩＬ６ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を製造業者のプロトコールに従って実施した。動物の管理および実験手順は、ナイメーヘン動物実験委員会から承認された施設プロトコルに基づいていました。

特に示さない限り、データは平均±標準偏差として示されます。グラフ内の個々のデータポイントは生物学的な複製であり、技術的な繰り返しではありません。データ点の数は各図で明確に識別でき、n は図の凡例に示されています。特に明記しない限り、統計分析はGraphpad Prism (v9、Graphpad Software)で実行されました。初代ヒト単球（ペア、ノンパラメトリック）を用いた訓練された免疫および急性刺激実験では、Wilcoxon 符号付き順位検定が使用されました。 RNA 配列解析の統計的方法は上で説明されています。 0.05 未満の両側 P 値は統計的に有意であるとみなされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付ける主なデータは、論文とその補足情報で入手できます。研究中に生成された生のデータセットと分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から研究目的で利用できます。生の RNA シーケンスデータは、NCBI Gene Expression Omnibus からアクセッション番号 GSE185433 で入手できます。

シンガー、M.ら。敗血症および敗血症性ショックの 3 番目の国際的コンセンサス定義 (敗血症-3)。 JAMA 315、801–810 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van der Poll, T.、van de Veerdonk, FL、Scicluna, BP & Netea, MG 敗血症の免疫病理学と潜在的な治療標的。ナット。イミュノール牧師。 17、407–420 (2017)。

論文 PubMed Google Scholar

Bruse, N.、Leijte, GP、Pickers, P.、Kox, M.、Expert Review of Clinical Immunology、Vol. 15、251–263 (テイラーとフランシス、2019)。

van der Poll、T.、Shankar-Hari、M.、Wiersinga、WJ 敗血症の免疫学。イミュニティ 54、2450–2464 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

フレイジャー、WJ およびホール、MW 免疫麻痺と重篤な病気による有害な転帰。小児科。クリン。北午前。 55、647–668 (2008)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

趙、GJら。敗血症性ショック患者における二次感染の発生率、危険因子、転帰への影響: 8年間の遡及研究。科学。議員第6号、38361 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Netea、MG、Joosten、LAB in Cell Vol. 175、1463–1465 (セルプレス、2018)。

Netea, MG、Quintin, J.、Van Der Meer、JWM の「細胞宿主と微生物」第 1 巻。 9、355–361 (2011)。

チェン、SCら。敗血症における免疫麻痺の根底には、白血球のエネルギー代謝における広範な欠陥があります。ナット。イムノール。 17、406–413 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Netea、MG et al. 訓練された免疫と健康と病気におけるその役割の定義。ナット。イミュノール牧師。 20、375–388 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ノバコビッチ、B.ら。 β-グルカンは、LPS によって誘導される免疫寛容のエピジェネティックな状態を逆転させます。セル 167、1354–1368.e14 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mulder, WJM、Ochando, J.、Joosten, LAB、Fayad, ZA & Netea, MG 訓練された免疫の治療的標的化。ナット。 Rev.DrugDiscov. 18、553–566 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Essner, R.、Rhoades, K.、McBride, WH、Morton, DL & Economou, JS IL-4 は、ヒト単球における IL-1 および TNF 遺伝子発現を下方制御します。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 142、3857–3861 (1989)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Woodward, EA、Prele, CM、Nicholson, SE、Kolesnik, TB & Hart, PH インターロイキン 4 の抗炎症効果は、サイトカインシグナル伝達 1 (SOCS1) のサプレッサーによって媒介されません。免疫学 131、118–127 (2010)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Czimmerer、Z.ら。転写因子 STAT6 は、炎症エンハンサーの直接抑制を媒介し、交互に極性化したマクロファージの活性化を制限します。免疫 48、75–90 e76 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schrijver、DP 他。アドバンスト・セラピューティクス Vol. 4、2100083–2100083 (John Wiley & Sons、2021)。

モルダー、WJら。マルチモダリティイメージング用の両親媒性物質と診断活性物質のナノ粒子集合体。準拠化学。解像度 42、904–914 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Soto-Heredero, G.、Gomez de Las Heras, MM、Gabande-Rodriguez, E.、Oller, J. & Mittelbrunn, M. 解糖系 - 炎症反応の主要人物。 FEBS J. 287、3350–3369 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マコーミック、SM & ヘラー、ニューメキシコ州解説: IL-4 および IL-13 受容体とシグナル伝達。サイトカイン 75、38–50 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Letellier、E. & Haan、S. SOCS2: 生理学的機能および病理学的機能。フロント。生物科学。 8、189–204 (2016)。

記事 Google Scholar

ヤン、Ｙら。ウイルス感染と予防における CCL19 および CCR7 の発現、シグナル伝達経路、アジュバント機能。フロント。セル開発バイオル。 https://doi.org/10.3389/fcell.2019.00212 (2019)。

キーティング、ST 他。 Set7 リジンメチルトランスフェラーゼは、β-グルカンによって誘導される訓練された免疫に必要な酸化的リン酸化の可塑性を制御します。 Cell Rep. 31、107548 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヴァン・レント、MMT 他ナノメディシンによる訓練された免疫の制御。ナット。メーター牧師。 7、465–481 (2022)。

記事 Google Scholar

Varin, A.、Mukhopadhyay, S.、Herbein, G. & Gordon, S. IL-4 によるマクロファージの代替活性化は、病原体の食作用を損なうが、微生物誘導性シグナル伝達とサイトカイン分泌を増強します。 Blood 115、353–362 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

D'Andrea , A. 、Ma , X. 、Aste-Amezaga , M. 、Paganin , C. & Trinchieri , G. ヒトによるサイトカインの産生に対するインターロイキン (IL)-4 および IL-13 の刺激および阻害効果末梢血単核細胞: IL-12 および腫瘍壊死因子アルファ産生のプライミング。 J.Exp. 医学。改訂 181、537–546 (1995)。

論文 PubMed Google Scholar

ディヴァンガヒ、M. 他。 Nature Immunology Vol. 22、2–6 (Nature Publishing Group、2021)。

デ・グラーフ、DMら。 IL-38 は、mTOR シグナル伝達を阻害することにより、訓練された免疫の誘導を防ぎます。Ｊ．ロイコック。バイオル。 110、907–915 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cavalli, G. et al. 抗炎症性サイトカインであるインターロイキン 37 は、訓練された免疫の阻害剤です。 Cell Rep. 35、108955 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

チェン、SCら。訓練された免疫の代謝基盤としての mTOR および HIF-1 α媒介の好気性解糖。サイエンス 345、1250684 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

サンダー、J. et al. ヒト単球の細胞分化は、時間依存性のインターロイキン 4 シグナル伝達と転写調節因子 NCOR2 によって制御されます。イミュニティ 47、1051–1066.e12 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Giamarellos-Bourboulis、EJ et al. 重度の呼吸不全を伴う新型コロナウイルス感染症患者における複雑な免疫調節不全。 Cell Host Microbe 27、992–1000.e3 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ザマン、R.ら。治療用タンパク質の半減期を延長する現在の戦略。 J.コントロール。リリース 301、176–189 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

プリエム、B.ら。訓練された免疫促進ナノ生物学的療法は腫瘍の増殖を抑制し、チェックポイント阻害を強化します。セル 183、786–801.e719 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

中村 K. & スミス MJ 腫瘍微小環境における骨髄性免疫抑制と免疫チェックポイント。細胞モル。イムノール。 17、1–12 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ペロス、AJ 他冠動脈バイパス移植は、単球および樹状細胞の免疫麻痺を伴います。Ｊ．Ｃｅｌｌ．モル。医学。 24、4791–4803 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヘルナンデス・ヒメネス、E. 他循環単球は、急性虚血性脳卒中後にエンドトキシン耐性状態を示します。脳卒中後の感染症の推定上の説明としてのミトコンドリア DNA です。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 198、2038 ～ 2046 年 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Tschoeke, SK & Ertel, W. 複数の外傷後の免疫麻痺。 Injury 38、1346–1357 (2007)。

論文 PubMed Google Scholar

Bekkering, S. et al. ヒト初代単球における訓練された自然免疫のインビトロ実験モデル。クリン。ワクチン。イムノール。 23、926–933 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

Dominguez-Andres, J. et al. 接着ヒト単球における訓練された免疫のインビトロ誘導。スタープロトコル 2、100365 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van Lier, D.、Geven, C.、Leijte, GP & Pickers, P. 全身性炎症のモデルとしての実験的ヒト内毒素血症。生化学 159、99–106 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

Langmead, B. 短いシーケンスリードを Bowtie と整列させる。カー。プロトック。バイオインフォマティクス https://doi.org/10.1002/0471250953.bi1107s32 (2010)。

Turro、E. et al. マルチマッピング RNA-seq リードを使用したハプロタイプおよびアイソフォーム特異的発現の推定。ゲノムバイオル。 12、R13 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Love, MI、Huber, W. & Anders, S. DESeq2 を使用した RNA-seq データの倍数変化と分散の適度な推定。ゲノムバイオル。 15, 550 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ハインツ、S.ら。系統を決定する転写因子の単純な組み合わせにより、マクロファージと B 細胞の同一性に必要なシス制御要素が刺激されます。モル。セル 38、576–589 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bekkering, S. et al. スタチンによる治療は、家族性高コレステロール血症患者の訓練された免疫を元に戻すことはありません。細胞メタブ。 30、1–2 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hirschfeld, M.、Ma, Y.、Weis, JH、Vogel, SN & Weis, JJ 最先端: リポ多糖の再精製により、ヒトとマウスの両方のトール様受容体 2 を介したシグナル伝達が排除されます。 J. Immunol. 165、618–622 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ovesný, M.、Křížek, P.、Borkovec, J.、Svindrych, Z. & Hagen, GM ThunderSTORM: PALM および STORM データ分析および超解像度イメージングのための包括的な ImageJ プラグイン。バイオインフォマティクス 30、2389–2390 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

フルオレセインイソチオシアネート標識カンジダ・アルビカンスを提供していただいた M. Yeter (Radboudumc) に感謝します。 D. Williams (東テネシー州立大学) は、最初の実験で使用した β-グルカンを提供してくれました。 H. Lemmers (Radboudumc) は、初代ヒト単球とマクロファージの刺激に使用する精製リポ多糖を親切に調製してくれました。図の一部は、(他のソフトウェアとともに) Biorender.com を使用して作成されました。 BN は、National Health and Medical Research Council (オーストラリア) の研究者助成金 (APP1173314) によって支援されています。この研究は、国立衛生研究所の助成金 R01 HL144072、R01 CA220234 および P01 HL131478、ならびにオランダ研究評議会 NWO からの Vici 助成金および ERC Advanced Grant (すべて WJMM へ) によって支援されました。 MGN は、オランダ研究評議会 NWO からのスピノザ助成金と ERC Advanced Grant (#833247) によって支援されました。

David P. Schrijver、Rutger J. Röring の著者も同様に貢献しました。

アイントホーフェン工科大学生体医工学部（オランダ、アイントホーフェン）

デヴィッド・P・シュライバー、ジェローン・デッカーズ、アン・デ・ドルー、エヴリン・G・ヌグラハ、ロデリック・S・ウースターウェイク、エウェリナ・クルーザ、ロイ・ファン・デル・ミール、マールテン・メルクス、ウィレム・J・M・モルダー

オランダ、ナイメーヘン、ラドバウド大学医療センター内科およびラドバウド感染症センター（RCI）

デビッド P. シュライバー、ルトガー J. レーリング、ジェローンデッカーズ、ヨハナ C. トナー、ブラムプリエム、ユーリヴァンエルサス、トムアンバーゲン、シモーネ JCFM ムアラグ、タイス J. ベルドマン、レオ AB ヨーステン、ミハイ G. ネテア、ウィレム JM モルダー

ラドバウド分子生命科学研究所、ラドバウド大学医療センター、ナイメーヘン、オランダ

ルトガー J. ローリング、ジェローンデッカーズ、トムアンバーゲン、アヌーク MD ベッカー、シモーネ JCFM ムアラグ、アーロンヤンセン、ピーターピッカーズ、マタイスコックス、レオ AB ヨーステン、ミハイ G. ネテア

米国ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学生体医工学画像研究所

ヨハナ・C・トナー、ジェフリー・プレヴォ、ブラム・プリエム、ジャズ・ムニッツ、ユーリ・ヴァン・エルサス、アンソニー・アズン、カルロス・ペレス＝メディナ、マンディ・MT・ファン・レント、アブラハム・JP・テウニッセン、ザヒ・A・ファヤド

アムステルダム大学医療センター、医生化学部門、アムステルダム、オランダ

ブラム・プライム

血管形成研究所、アムステルダム UMC、アムステルダムがんセンター、アムステルダム、オランダ

ブラム・プライム

オランダ、ナイメーヘンのラドボウド大学医療センター外科

ラズロ・A・グロー

ラドバウド健康科学研究所、ラドバウド大学医療センター、ナイメーヘン、オランダ

ラズロ・A・グロー

オランダ、ナイメーヘン、ラドボウド大学医療センター、RIMLS、腫瘍免疫学部

アヌーク MD ベッカー

国立心臓血管研究センター (CNIC)、マドリード、スペイン

カルロス・ペレス・メディナ

エピジェネティクスグループ、マードック小児研究所、王立小児病院、メルボルン大学小児科、パークビル、ビクトリア州、オーストラリア

ボリス・ノヴァコビッチ

オランダ、ナイメーヘンのラドバウド大学医療センター、集中治療科およびラドバウド感染症センター（RCI）

アーロン・ジャンセン、ピーター・ピッカーズ、マタイス・コックス

米国ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学心臓血管研究所

マンディ MT ファンレント & エイブラハム JP トイニッセン

イウリウ・ハティエガヌ医科薬科大学、ルーマニア、クルージ・ナポカの医療遺伝学科

レオ AB ヨーステン

ニューヨーク大学医学部、医学部、心臓病科、マークおよびルーティ・ベル血管生物学プログラム、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

エドワード・A・フィッシャー

ボン大学、生命医科学研究所 (LIMES)、ゲノミクスおよび免疫制御部門、ボン、ドイツ

ミハイ・G・ネテア

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

WJMM と MGN は研究を概念化しました。 WJMM、MGN、ZAF、EAF、RvdM がこの研究を監督しました。 RJR、SJCFMM、LABJ は、IL4 の作用機序を解明しました。 DPS、JD、AdD、MM は融合タンパク質を設計、発現、最適化しました。 DPS、JD、AdD、RSO、EGN、GP、AA、CP-M.、EK、および AJPT は、ナノ粒子を生成、標識、および特性評価しました。 DPS、RJR、LAG、AMDB、BN、MK、AJ、PP、および TJB は、ex vivo (ヒト)、in vivo および in vitro 実験を実施しました。 DPS、RJR、YCT、JD、BP、JM、YvE、TA、および MMTvL は、マウス非ヒト霊長類の in vivo および ex vivo 実験を実施しました。 DPS、RJR、MGN、WJMM が原稿を書き、図を作成しました。著者全員が原稿をレビューし、フィードバックを提供しました。

ミハイ・G・ネテアまたはウィレム・J・M・モルダーへの通信。

WJMM、LABJ、および MGN は、Trained Therapeutix Discovery の科学的共同創設者であり、株式を保有しています。 WJMM は、Trained Therapeutix Discovery の CSO です。 WJMM と MGN は BioTrip の科学共同創設者であり、BioTrip の株式を保有しています。

Nature Biomedical Engineering は、この研究の査読に貢献してくれた Jeffrey Hubbell、Srinivasa Reddy、Markus Weigand に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(a) IL4 による 24 時間刺激後の上清乳酸レベル。 (b) IL4 トレーニング後 6 日目の蓄積上清乳酸レベル。 (c)IL4トレーニング後6日目のFITC標識カンジダ・アルビカンス食作用のフローサイトメトリー測定。（ d ）IL4トレーニング後6日目の、単球/マクロファージのIL4活性化に一般的に関連する表面マーカーのフローサイトメトリー測定。（ e ）IL4で訓練されたマクロファージおよび単球由来樹状細胞（moDC）上の樹状細胞マーカーCD1cのフローサイトメトリー測定。データは平均値 (フローサイトメトリー: 幾何平均蛍光強度) ± SD として表示されます。

(a) 主要な IL4 シグナル伝達ルートをブロックしながら IL4 でトレーニングした細胞を再刺激した後の TNF/IL6 産生 (b) 主要な IL4 シグナル伝達ルートをブロックしながら IL4 でトレーニングした細胞の再刺激後の TNF/IL6 の増加倍数。 (c) 単球の単球のトランスクリプトームのヒートマップ。単離直後、および RPMI、IL4、LPS、または LPS + IL4 で刺激した後。（ d ）LPS刺激単球に対するIL4の急性効果の転写因子モチーフ濃縮分析。（ e ）急性LPS刺激に対するIL4の効果の経路濃縮分析。 (f) IL4 トレーニング細胞における TNF の ChIP-qPCR 分析。データは平均値 ± SD として表示されます。

SPRを使用したIL4RαへのIL4結合の動態。

(a) 従来の aNP 粒子サイズの DLS 評価。 (b) 従来の aNP の経時的な DLS 安定性。

(a) マウスへの 89Zr-IL4-aNPs 注射から 24 時間後の臓器オートラジオグラフィー。 (b) マウスへの 89Zr-IL4-aNPs 注射から 24 時間後の重要臓器のガンマ数 (n = 5)。（ c ）マウスにおけるクリアランス臓器に対する標的臓器による取り込み比、トルコ事後分析を用いた二元配置分散分析。（ d ）89Zr-IL4-aNPs注射後1、30、および60分後の非ヒト霊長類の動的PET / MRIスキャン。（ e ）89Zr-IL4-aNPs投与後1時間にわたる非ヒト霊長類における臓器特異的SUV平均。（ f ）DiO標識円盤状IL4-aNPの細胞型特異性を測定する実験における骨髄（上）および脾臓（下）のゲーティング戦略。データは、必要に応じて平均値 ± SD として表示されます。

(a) RPMI、IL4、またはさまざまな濃度の IL4-aNP で 30 分間刺激した後、フローサイトメトリーによって測定された STAT6 のリン酸化。データは、裸の IL4 によって引き起こされるシグナルと比較して表されます。（ d ）IL4（-aNP）で訓練されたマクロファージまたはコントロールとの混合白血球反応の7日後のフローサイトメトリーによるT細胞極性アッセイ。 (b) ヒトにおける in vivo エンドトキシン攻撃前およびその 4 時間後に単離された単球の LPS 刺激後の TNF 産生。（ c ）ヒトin vivo LPS寛容細胞のex vivo再刺激後のTNFおよびIL6レベル（左）および寛容内毒素血症サンプルと比較した倍率変化として表された同じデータ（右）。

補足表1〜5、および図3の未処理のSDS-PAGEゲルおよびウェスタンブロット。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Schrijver、DP、Röring、RJ、Deckers、J. 他インターロイキン 4 を骨髄細胞に標的化することで、訓練された免疫を介して敗血症誘発性免疫麻痺を解決します。ナット。バイオメッド。工学 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41551-023-01050-0

引用をダウンロード

受信日: 2021 年 12 月 21 日

受理日: 2023 年 5 月 2 日

公開日: 2023 年 6 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01050-0

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

前: 農薬市場の成長次: ダブルの合成

お問い合わせを送信

送信