DSF 不活化因子 RpfB 相同 FadD は鉄制限条件下で Bradyrhizobium japonicum で上方制御される

Jun 12, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8701 (2023) この記事を引用

202 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

植物病原性細菌 Xanthomonas Campestris pv. Campestris (Xcc) は黒腐病やその他の植物の病気を引き起こします。 Xcc は、主に鉄の取り込みと毒性を媒介するクオラムセンシング (QS) シグナルとして拡散性シグナル因子 (DSF) を感知します。 RpfB は、この DSF-QS 回路の DSF を非アクティブにします。 我々は、低鉄条件と高鉄条件下で Bradyrhizobium japonicum の異なる遺伝子発現プロファイルを調べ、fadD と irr が低鉄条件下で上方制御されることを発見しました (log2 倍変化はそれぞれ 0.825 と 1.716)。 FadD は、類似したタンパク質のフォールディング パターンと機能ドメインの類似性を有することに加えて、Xcc の RpfB と 58% の配列類似性を共有しました。 RpfB – DSF および FadD – DSF 複合体の SWISSDock 分子ドッキングスコアはそれぞれ - 8.88 kcal/mol および - 9.85 kcal/mol であり、100 ns の分子動力学シミュレーション結果はドッキング結果と一致しました。 ただし、FadD-DSF と RpfB-DSF の結合エネルギーの間には有意な差が見つかり、FadD 依存性の DSF 代謝回転の可能性が示されました。 タンパク質間相互作用ネットワークは、FadD が ABC トランスポーター パーミアーゼ (ABCtp) と間接的に結合しており、これも上方制御されている (log2 倍率変化 5.485) ことを示しました。 我々は、低鉄条件が B. japonicum における fadD 上方制御の模倣環境刺激であり、DSF を不活性化し、鉄の取り込みと DSF 産生近傍の毒性を阻害する可能性があると推測しています。 この発見は、B. japonicum または遺伝的に改良された B. japonicum を Xcc に対する潜在的な生物防除剤として使用するという新たな選択肢を提供し、さらに植物の成長促進特性という利点をもたらします。

鉄は、酸素、ケイ素、アルミニウムに次いで地球の地殻に最も遍在する元素です。 鉄は通常、第一鉄 (Fe2+) または第二鉄 (Fe3+) の酸化状態で存在します1。 第二鉄は、地球の酸素環境中で主に存在する形態ではあるものの、溶解度が比較的低いため、好気性代謝を行うバクテリアにとって課題となります。 低 pH では、嫌気性または微好気性環境では、溶解度の高い第一鉄が最も豊富に存在します2。 鉄は調節酵素や代謝酵素の活性に不可欠であり、そのため細菌の生理学にとって鉄は不可欠です。 しかし、鉄は生理的 pH で電子を輸送する可能性があるため、細胞にとって有毒となる可能性があります。 細菌は、鉄が不足している場合には環境から鉄を積極的に収集し、鉄が豊富な場合には細胞内の遊離鉄の利用可能性を制御するメカニズムを進化させてきました3。 この鉄の恒常性は、毒性と正常な細胞プロセスの両方にとって重要です1。 鉄取り込み調節因子 (Fur) は、鉄の恒常性、病原性、酸化ストレスの包括的な転写調節因子です4。 毛皮は大腸菌で広く研究されており 5、90 を超える遺伝子の鉄依存性発現を調節することが示されています 6。 ファーは、鉄（そのコリプレッサー）と相互作用すると転写を抑制し、鉄が存在しない場合には転写を抑制するため、ポジティブリプレッサーとして機能します6。 Fur は、サブユニットごとに 1 つの鉄イオンに結合するホモ二量体 DNA 結合タンパク質です。 低い鉄濃度では、apo-Fur (鉄を含まない Fur) の DNA 結合親和性は、Fur の DNA 結合親和性の約 1000 倍低く、その活性が低下するため、鉄の吸収、RyhB small RNA の抑制、鉄の貯蔵量の減少、および鉄の量の減少が起こります。鉄タンパク質合成6. シデロフォアは、鉄を獲得するために細菌によって合成される細胞外第二鉄キレート分子です7。 サイドロホアを産生できない細菌株は、他の細菌株が産生するシデロホアを利用することが多く、これにより種間競争や鉄制限条件下で優位性が得られます8。 細菌は、ヘム吸収や第一鉄輸送システムなど、他の鉄獲得メカニズムを備えています2,9。 しかし、fur 変異株では適切な鉄恒常性が欠如しており、常に高いシデロホア産生の結果として高濃度の細胞内鉄が検出された4。 宿主植物では、fur 変異株は酸化ストレス耐性が低下し、病原性形質が減少しました 4,10。 これらの発見は、植物病原性細菌の病原性における鉄と毛皮の重要性を強調しています。

根粒菌は土壌に生息するα-プロテオバクテリアで、マメ科植物（大豆など）と共生関係を築くことができます11。 共生関係において、植物の成長を促進する根粒菌は、窒素固定、リン酸可溶化、植物ホルモン生産、抗生物質生産、クオラムセンシング（QS）干渉などを含むがこれらに限定されないさまざまなメカニズムを通じて植物の発育を促進します12。 ほとんどの細菌は、細胞密度に依存するコミュニケーション機構として QS を使用します13。 QS は主に N-アシル ホモセリン ラクトンによって媒介され、細菌の社会生活は QS によって部分的に決定されます。 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．などの植物病原性細菌において。 Campestris (Xcc)、QS は、DSF、cis-2-ドデセン酸 (BDSF)、cis,cis-11-メチルドデカ-2,5-ジエン酸 (IDSF) などの拡散性シグナル因子 (DSF) ファミリーメンバーによって媒介されます。 ）、トランス-2-デセン酸（SDSF）および蘇生促進因子RpfBは、DSF代謝回転を調節します14。 Escherichia coli、Sinorhizobium meliloti、Agrobacterium tumefaciens の長鎖脂肪酸 CoA リガーゼ (FadD) 配列は、Xcc15 の RpfB 配列と相同です。 ホモセリンラクトンまたは DSF の酵素変換による QS シグナルの破壊はクオラム クエンチングと呼ばれ、QQ は細菌種の競争適応性を向上させることがよくあります 16。 Bradyrhizobium japonicum は、植物の成長を促進する根粒菌です12。 B. japonicum LO 株では、鉄ホメオスタシスと鉄制御遺伝子は鉄応答制御因子 (Irr) タンパク質によって制御されており、ヘム生合成に限定されません 5。 この研究では、NCBI 遺伝子発現オムニバス データセット (GEO: GSE4143) のマイクロアレイ発現プロファイルと STRING を使用したタンパク質間相互作用を使用して、低鉄条件および高鉄条件下での B. japonicum 株 LO における差次的な遺伝子発現レベルを分析しました。 我々は、B. japonicum の fadD 遺伝子の発現が低鉄条件下で上方制御されることを発見しました (log2 倍数変化 (FC) 0.825)。 また、B. japonicum FadD と Xcc RpfB のアミノ酸配列は 58% の同一性を共有し、FadD-DSF の結合エネルギーは RpfB-DSF の結合エネルギーよりも有意に高く、FadD 依存性の DSF 代謝回転の可能性を示していることもわかりました。 我々は、低鉄条件は、fadDを上方制御してDSFを不活性化し、鉄の取り込みを阻害し、DSFを産生する近隣菌の毒性を阻害するB. japonicumにとって模倣的な環境刺激である可能性があると推測している。

GEO データセット GSE4143 の分析により、642 個の遺伝子が低鉄条件 (低鉄対高鉄) 条件下で有意に差次的に発現 (DEG) することが示されました (図 1)。 642 DEG のうち 457 のみがさらなる分析に使用されました (補足表 S1)。 642 個の DEG のうち、384 個が上方制御され、258 個が下方制御されました (図 2a)。 B. japonicum の fadD 遺伝子と irr 遺伝子は上方制御されました (log2 FC 0.825 と 1.716) (図 2b)。 注目すべきことに、ABCトランスポーターパーミアーゼ遺伝子(ABCtp、blr3355)も上方制御されていた(log2 FC 5.485)。

低鉄条件と高鉄条件で生育した Bradyrhizobium japonicum の間で差次的に発現される遺伝子。 (a) 火山プロット。 (b) log2 倍数変化 (x 軸) 対 log2 発現平均値 (y 軸) を示す平均差プロット。 Benjamini-Hochberg 誤検出率調整 p 値が < 0.05 の場合、遺伝子は有意に差次的に発現するとみなされました。 (c) 低鉄条件と高鉄条件の間で有意に差次的に発現される遺伝子の重複のベン図。 この分析では、Gene Expression Omnibus GSE4143 データセットが使用されました。 グラフィック プロットは GEO2R 分析ツールを使用して生成され、読みやすくなりました。

差次的発現遺伝子 (DEG) と濃縮された KEGG 代謝経路。 (a) 低鉄条件と高鉄条件の間の 642°の分割線プロット。 (b) 高鉄条件と比較した低鉄条件におけるirrおよびfadDの発現レベルの差異。 (c) カットオフフィルターを使用しない DEG の KEGG 代謝経路。 クオラム センシング経路の濃縮率は 1 個の入力遺伝子 (fadD) と 19 個のバックグラウンド遺伝子で 0.01 と非常に低かった。 KEGG 経路は、その機能に基づいて 8 つの主要なクラスター (C1 ～ C8) に分類されました。

DEG の Benjamini-Hochberg FDR (P < 0.05) を用いた京都遺伝子とゲノム百科事典 (KEGG) 経路濃縮分析では、下方制御された遺伝子のほとんどが鞭毛集合、リボソーム、酸化的リン酸化、代謝経路、炭素固定に関与していることが示されました。光合成生物では、ポルフィリンとクロロフィルの代謝、炭素代謝、多様な環境における微生物の代謝、グリオキシル酸、ジカルボン酸の代謝、二次代謝産物の生合成（補足表S2）、一方、上方制御された遺伝子のほとんどは硫黄リレー（moaE、moaD、moaD、 mnmA）およびベータラクタム耐性（acrB、ampC、acrA）経路（補足表S3）。 さらに、Benjamini-Hochberg FDRフィルター設定なしでKEGG Orthology Based Annotation System（KOBAS）を使用し（p < 0.05）、1つの遺伝子（fadD）と19のバックグラウンド遺伝子を持つQS経路を特定しました（図2c）。

我々は、DEGの大規模なタンパク質間相互作用（PPI）ネットワークを構築し（補足図S1）、上位50のハブノードにコードされたタンパク質が2つの重要なKEGG経路、すなわちリボソーム経路と鞭毛集合経路に関与していることを発見した。 リボソーム経路のrpmCタンパク質と鞭毛集合経路のノード2734684は、これら2つの代謝経路を接続します（図3a）。 特に、上位 15 のボトルネック ノードには Irr タンパク質が含まれていましたが、FadD は上位 50 のハブまたは 15 のボトルネック ノードには含まれていませんでした (図 3b)。 PPI ネットワークは、FadD、鞭毛アセンブリ、リボソーム、根粒形成クラスターなどのサブネットワークで構成されています (補足図 S1)。 FadD は、特定のノード、つまり 27354240、27354241、27354239、27354242、27352300、27349302、27351614、27351617、27348347 と対話します (図 3c)。 FadD PPI クラスターの別の STRING17 ベース分析により、FDR 調整後の p 値がそれぞれ 7.64e-09 および 2.82e-05 である重要な QS および ABC トランスポーター経路が特定されました (表 1)。 さらに、FadD および 27354240 は QS 経路のみに参加しましたが、27354239、27354241、27354242、27352300、27349302、および 27351614 は QS および ABC トランスポーター経路に参加しました。 さらに、ノード27351614および27348347は、細胞の鉄恒常性を含むさまざまな経路に関与しました（図3c）。 結果はまた、FadD が ABCtp に間接的に接続されており、上方制御されていたことも示しました (log2 FC 5.485) (図 3d)。

差次的に発現される遺伝子のタンパク質間相互作用 (PPI) ネットワーク、およびハブ ノードとボトルネック ノード。 (a) PPI ネットワーク内の上位 50 のハブ ノード。 接続しているハブ ノードは青いボックス内にあります。 (b) PPI ネットワーク内の上位 15 のボトルネック ノード。 Irrタンパク質は右下です。 (c) PPI ネットワーク内の FadD クラスターを分離し、STRING を使用して調査しました。 ノードは、関係する経路に応じて複数の色で表示されます。赤、クォーラム センシング (bja02024)58、59、60。 青、ABC トランスポーター (bja02010)58,59,60; フェレドキシン NADP レダクターゼと細菌を含む混合物。 黄色の細胞鉄イオン恒常性 (ローカル ネットワーク クラスター (STRING)、CL: 1531)。 (d) クオラムセンシングやABCトランスポーター経路など、さまざまな経路に関与するノード遺伝子の差次的発現レベル。

B. japonicum FadD と Xcc RpfB のアミノ酸配列のアラインメントにより、それらが 58% の類似性を共有し (補足​​図 S2)、配列内の非常に類似した位置に同一のタンパク質ファミリー ドメインがあることが示されました (補足表 S4)。 多重配列アラインメントおよび系統樹は、B. japonicum FadDが、Xcc RpfB配列と相同であることがすでに知られている他の細菌FadDアミノ酸配列に著しく類似していることを示した(図4)。 UCSF Chimera19 の RRDistMaps ツールを使用した、AlphaFold18 の RpfB (AF-Q8P9K5-F1) と FadD (AF-A0A0A3XRM6-F1) のタンパク質構造の予測構造評価により、それらの三次元構造の類似性が検出されました (補足図 S2)。 RpfB と B. japonicum FadD の TM-align20 スコアはそれぞれ 0.95995 と 0.95828 であり、構造が非常に類似していることが確認されました。

Bradyrhizobium japonicum、関連細菌種および Xcc の RpfB の FadD アミノ酸配列の比較。 (a) 多重配列アラインメント、および (b) 系統樹。 ブートストラップ値はブランチの横に表示されます。

CB-Dock221 と AutoDock Vina22 を使用した RpfB–DSF と FadD–DSF の分子ドッキング スコアには大きな差はありませんでしたが (図 5)、SWISSDock23 と fastDRH24 のスコアは大きく異なりました。 具体的には、RpfB–DSFのSWISSDockスコアは-8.88kcal/mol、fastDRH MM-PBSAおよびMM-GBSAスコアはそれぞれ-22.27kcal/mol、-34.07kcal/molであったのに対し、FadD-DSFのSWISSDockスコアは-9.85kcal/molでした。 fastDRH MM-PBSA および MM-GBSA スコアは、それぞれ - 34.02 kcal/mol、および - 38.07 kcal/mol でした (表 2)。 RpfBとDSFの間の接触残基はPRO84、ASN85、PRO108、LEU109、ILE130、ASN132、PHE133、LEU154、LEU176、THR259、ALA260、LEU261、PRO262、LEU263、TYR264、ILE286、SER287、ASN288、PRO289であった。 、ARG290、一方FadDとDSFの間の接触残基はASN236、TRP239、LEU240、PHE265、ALA269、LEU273、ILE331、ASN333、GLY334、GLY335、GLY336、MET337、GLfY358、TYR359、GLY360、LEU361、PRO366、THR367であった。 、THR369、および CYS370 (補足)図S3)。 さらに、リガンドの複数のドッキングポーズの残基ごとのエネルギー分解分析に基づいて、潜在的なホットスポット残基の上位 10 位とヒートマップ残基の上位 30 位が特定されました（補足図 S4）。 したがって、それら（補足図S4）は、RpfB Xccに対する将来の薬剤設計の取り組みにおそらく非常に役立つでしょう。

分子ドッキングおよび分子動力学 (MD) シミュレーションによる、受容体 RpfB および FadD とリガンド DSF 間の生物物理学的相互作用。 （a、b）XccのDSFとRpfBの間の分子ドッキング（a）、およびBradyrhizobium japonicumのDSFとFadDの間の分子ドッキング（b）。 DSF は、赤いボールとスティックの構造によって示されます。 (c、d) 複合体中の受容体とリガンドの RMSD。 (e、f) 複合体中の受容体とリガンドのRMSF。 (g) 受容体タンパク質の回転半径 (Rg)。 (h) 100 ns の分子動力学シミュレーション中に生成された受容体 - リガンド複合体を使用して計算された H 結合の数と H 結合に関与するアミノ酸残基。 閾値は破線で示されています。

分子ドッキングの結果を確認するために、DSF と複合体を形成した FadD および RpfB タンパク質の暗黙的な溶媒和モデルに基づいて結合の自由エネルギーを推定しました。 100 ns MD 軌跡を使用した MM-PBSA/GBSA 計算では、FadD-DSF に対する結合親和性が RpfB-DSF に対する結合親和性よりもはるかに高いことが示され (表 2)、分子ドッキングの結果が裏付けられました。 リガンド分子の親油性の性質により、ファンデルワールス力がタンパク質とリガンドの親和性に主に寄与しました。

シミュレーション中の2つの複合体の動きを調べるために、二乗平均平方根偏差（RMSD）と変動（RMSF）の値、および回転半径（Rg）が時間に対してプロットされました（図5c〜g）。 FadD – DSFのRMSD値（RMSD = 3.64Å）はRpfB – DSFの値（RMSD = 2.78Å）よりも高く、FadDがRpfBよりも初期状態から大きく逸脱していることを示しています（図5c）。 FadD-DSF複合体のリガンドRMSDは1.0Åの閾値で変化しませんでしたが、RpfB-DSF複合体のリガンドRMSDはおそらくDSFが結合部位から放出されたため大きく変化しました（図5d）。 受容体RMSF値により、RpfBのN末端領域およびC末端領域の高い柔軟性に関連するアミノ酸残基が同定されました（図5e）。 DSF の RMSF 値は、受容体の RMSF 値と同様の柔軟性パターンを示しました。 つまり、DSFは、FadD-DSF複合体よりもRpfB-DSF複合体の方が柔軟でした（図5f）。 Rg 値は、RpfB が複合体中で FadD よりもコンパクトであることを示しました。 つまり、Rg 値は、RpfB よりも FadD の方が高かった（図 5g）。

受容体とそのリガンド間の水素結合の数を評価して、結合親和性に対する水素結合の寄与を決定しました。 FadD と DSF の間の結合親和性は高かったが、H 結合の形成には 2 つのアミノ酸 (Gly336 と Gly360) のみが関与していました。 しかし、9つのアミノ酸残基がRpfBとDSFの間のH結合の形成に関与しており、おそらくリガンドが結合部位から放出されたため、結合親和性は低かった(図5h)。

細菌は通常、限られた生命資源をめぐって競合するさまざまな株や種に囲まれています25。 したがって、細菌は、資源（例えば、鉄のシデロフォア）を集めるための分泌物を含むがこれらに限定されない、近隣の細胞を損傷または中毒させ26、他の生物がそうするのを妨げながら微小コロニーを確立するなど、近隣の細菌を間引き、排除する戦略を開発してきた27。 バイオフィルムは、細胞外ポリマー物質 (EPS) に囲まれた表面結合微生物細胞の集合した微小コロニーであり、主に QS28 によって支配されます。 QS は、Xcc29 の毒性とバイオフィルム形成の制御にも重要な役割を果たします。 逆に、B. japonicum などの植物成長促進根粒細菌は、隣接する植物病原性細菌の QS 干渉またはクオラム クエンチングによって植物の成長を促進できます 10,12。 最近、DSF ファミリーシグナルを含む QS シグナルに大きな焦点が当てられており 30、QS が利点や競合相互作用と関連していることが判明しました 26。 DSF および BDSF は Xcc14 の QS プロセスメディエーターであり、RpfB はその脂肪アシル CoA リガーゼ活性を介した β 酸化によって DSF を不活性化できます 31。 さらに、DSF は宿主植物の発育、成長、免疫を潜在的に損なう可能性があります 31。 Xcc では、高い細胞外濃度の DSF が高い細胞密度で RpfC-RpfG システムを活性化し、いくつかの病原性因子の発現と鉄の吸収を調節する全体的な転写因子 Clp に対する c-di-GMP の阻害を緩和します 32。 Xcc rpfF は DSF および rpfF ホモログ変異体 Xanthomonas oryzae pv を産生しました。 増殖とDSF産生が欠損したオリゼ（Xoo）株33。 Xoo は、イネに細菌性枯病を引き起こす植物病原性細菌です。 Xoo rpfF ホモログ変異株は、低鉄条件下では異常なテトラサイクリン感受性を示し、鉄補給時にはテトラサイクリン耐性を示しました 33。 イネにおける Xoo の鉄依存性病原性が報告されています 34。 Xcc は、低鉄条件下で最大の毒性と増殖に必要なシデロフォアであるキサントフェリンを生成できます 35。 キサントフェリンは第二鉄と結合し、宿主植物における Xcc の成長を促進します 35。 これらの発見は、植物病原性細菌の病原性形質の発現における鉄とDSF依存性QSシステムの重要性を示しています。

E. coli、S. meliloti、および A. tumefaciens の FadD 配列は、Xcc RpfB 配列の相同体です15。 しかし、B. japonicum FadD と Xcc RpfB の間の相同性はこれまでに報告されていません。 B. japonicum FadD と Xcc RpfB のアミノ酸配列のアラインメントにより、それらが 58% の類似性を共有することが示されました (補足図 S2)。 配列の類似性は、タンパク質の機能についての洞察を提供します 36。 2 つのモデルタンパク質の三次元構造の TM-align スコアは、それらの残基の等価性を比較することによって取得できます20。 Ｘｃｃ ＲｐｆＢおよびＢ． したがって、配列類似性の共有に加えて、それらはタンパク質の折り畳みパターンとタンパク質ファミリードメインを共有しており（補足表S4）、2つのタンパク質間の潜在的な機能的類似性を示しています。 さらに、RpfB – DSF における RpfB の RMSD は、MD 軌跡全体を通じて FadD – DSF における FadD の RMSD よりも低かった。 RMSD は、タンパク質の初期構造と最終構造の違いを測定します。 タンパク質構造の MD 軌道中の不一致は、その立体構造の安定性を示している可能性があります 37。 FadD の場合、RMSD 変動は約 4 ～ 6 Å (約 40 ～ 100 ns) を超えず、変動範囲が小さいことを示しています。 2 つの錯体のリガンドでは、RMSD 変動は逆の傾向を示しました。 DSF の RMSD 変動は、MD 軌道全体を通じて、FadD-DSF よりも RpfB-DSF 複合体の方が大きかった (図 5)。 RMSD の小さな変動は、リガンド結合が安定していることを示しています 38。 RMSF は、MD 軌跡上の基準点からのアミノ酸残基の平均変位を定量化するため、初期構造から最も逸脱している構造領域を特定できます 39。 注目すべきことに、RpfB-DSF と FadD-DSF の一部のタンパク質領域（C 末端から約 150 ～ 160 および 455 番目）は同様の変動を示し、平均して、RpfB-DSF と FadD-DSF の RMSF はほぼ同様であった。満足のいく受容体-リガンド相互作用。 Rg はタンパク質の軸の周りの原子の分布を示し、タンパク質が回転しているときの点と、エネルギーの移動が可能な限り最大の影響を与える点との間の距離の尺度です40。 RpfB-DSF の RpfB では、Rg は 23.5 Å ～ 24.5 Å の間に留まりました。 FadD–DSF の FadD の場合、Rg は 40 ns 後に変動し始め、その後 100 ns まで 25 Å 付近に留まりました。 FadD-DSF の GLY336 によって形成されると予測された 500 以上の H 結合は、受容体 - リガンド相互作用における GLY336 の単一の優位性を示していますが、RpfB-DSF では多数のアミノ酸残基が H 結合を形成すると予測されました。 水素結合はタンパク質構造の生成と安定化に役立つため 41、MD 軌道全体にわたる水素結合の形成は、RpfB-DSF および FadD-DSF における安定した受容体 - リガンド相互作用を示唆しています。

2 つの実験条件間の遺伝子発現レベルの統計的に有意な差は、DEG を特定するために使用されます 42。 我々は、低鉄条件と高鉄条件下での遺伝子発現レベルを比較することにより、B. japonicum の 642°を同定しました（図 1）。 Irr タンパク質と FadD は、鉄の恒常性と QS またはクオラム クエンチングにとって重要です。 我々は、B. japonicum の fadD と irr が低鉄条件下で上方制御されることを発見しました (それぞれ log2 FC 0.825 と 1.716)。 さらに、細胞の鉄の状態を適切に把握するには Irr タンパク質が必要であることが報告されています 5。 また、irr 変異株には正常な鉄応答と鉄関連遺伝子が存在しないため、細胞の総鉄含有量が減少することが判明しました5。 Irr タンパク質のこれらの特徴は、低鉄条件下での Irr の上方制御を説明します。 しかし、低鉄条件下での B. japonicum における fadD 上方制御の重要性は、以前の研究では説明されていません。

本研究では、遺伝子リストの機能強化分析により、鞭毛集合体とリボソーム経路がFDR調整p値<0.05の上位2つの経路として特定され（補足表S2）、これら2つの代謝経路に関連する遺伝子は上位50に入っていました。 PPI ネットワーク内のハブ ノード (図 3a)。 さらに、これら 2 つの経路を接続するハブ ノード、リボソーム ネットワークからの rpmC と鞭毛集合ネットワークからの 27348641 が非常に重要であることがわかりました (図 3a)。 ただし、PPI ネットワーク全体のボトルネック ノードの上位 15 位には Irr タンパク質のみが含まれていましたが (図 3b)、FadD はボトルネック/ハブ ノード上位 50 位には含まれていませんでした。 特に、fadD の発現レベル (log2 FC 0.825) は、Irr タンパク質の発現レベル (log2 FC 1.716) のほぼ半分でした。 この発見は、鉄の利用可能性が制限されているときに、なぜ B. japonicum で高い fadD 発現が起こるのかという疑問を引き起こします。

細菌において、鉄は DNA 複製、転写、代謝、呼吸によるエネルギー生産、および病原性において重要な生理学的役割を果たしています 3。 鉄が不足すると、他の微生物による鉄の取り込みを妨げるプロセスが引き起こされ、それによって自己の生存に最適な条件が確保されます。 鉄代謝、走化性、鞭毛運動性に関連する遺伝子の発現を協調的に制御する第二鉄結合転写因子XibRが、Xcc43の最適な毒性に必要であることが判明した。 低鉄条件では、XibR 変異株は成長の低下と細胞内鉄濃度の低下を示しました 43。 細菌の病態生理学における鉄代謝の重要性は、強力な殺菌剤であるシンジュナン（ジオクチルジエチレントリアミン）が細胞の鉄代謝を変化させることによって作用するという発見によってさらに裏付けられています44。

fadD に加えて、fadE や fadR などの他の遺伝子も大腸菌の β 酸化に重要な役割を果たすことが示されています 45。 興味深いことに、fadE、fadF、fadG、fadH、fadL、および転写調節因子fadRも細菌の脂質代謝に関与していることが判明しました46が、これらの遺伝子はいずれも、低鉄条件と高鉄条件を比較した場合、B. japonicumにおいて差次的に発現されませんでした（補足表） S1)。 資源が限られた条件下では、細菌は一般にエネルギー効率の高い経路を選択し、不必要な転写は通常、大腸菌のラクトースオペロンなどのオペロンによって妨げられます47。 我々は、fadDが低鉄条件下でB. japonicumで上方制御されることを発見し（図3c）、fadDの高発現が他の要因に起因する可能性があることを示唆しています。 PPIネットワークのFadDクラスターのSTRINGベースの分析（補足図S1）により、QSおよびABCトランスポーター経路という2つの重要なKEGG経路が見つかりました（表1）。 ただし、STRING および KEGG ベースの経路予測には、これらの方法が複数種の相互作用に最適化または適応されていないため、制限があります。 実際、広範囲の微生物が細菌の典型的な生息者であるため、均質または同質の細菌群集はまれです48。 さらに、細菌は、細胞シグナル伝達経路または代謝経路を通じて資源が不足している場合、隣の細菌を傷つけたり、競争したりする可能性があります27。 他のDEGの中で、ABCtp（blr3355）は上方制御され（log2 FC 5.485）、間接的にFadDに接続されました（図3d）。 パーミアーゼは、タンパク質を細胞の外に輸送できる膜輸送タンパク質 36 です。 低鉄条件下での ABCtp (blr3355) の高発現は、ABCtp (blr3355) が必要であり、おそらく FadD の細胞外輸送に関連していることを示しています。 さらに、ABC トランスポーターは、2 つの異なる QS 機構によって肺炎球菌において上方制御されることが判明しました 49。

QS は種間の競争 50 と協力 51 において重要な役割を果たしており、種を超えた QS 阻害が報告されています 52。 RpfB は Xcc14 の DSF を不活性化し、Xanthomonas Campestris と同様に細胞の鉄吸収の環状ジ GMP および Clp 媒介シグナル伝達回路を破壊する可能性があります 31,32,53,54,55,56 (図 6a)。 さらに、B. japonicum FadDとXcc RpfBは相同であり（図4）、FadD-DSFとRpfB-DSFの結合エネルギーに有意な差が検出されました（補足表S3）。これは、潜在的なFadD依存性DSF代謝回転を示しています（図4） .6b）。 したがって、我々は、低鉄条件が B. japonicum における fadD 上方制御の模倣環境刺激であり、DSF を不活性化し、DSF 産生近傍の鉄取り込みと毒性を阻害する可能性があると推測しています。 これは、なぜfadDとABCtpが低鉄条件下でB. japonicumにおいて上方制御されたのかを説明する可能性がある。

DSF媒介細胞応答の分子シグナル伝達カスケードの提案。 (a) Xanthomonas Campestris における DSF を介したクオラム センシング、KEGG (bja02024)58,59,60 から取得。(b) Xcc の DSF と Bradyrhizobium japonicum の RpfB ホモログ FadD を介した種間コミュニケーションの考えられる作用機序。

我々は、低鉄および高鉄条件下での B. japonicum の差次的遺伝子発現を分析し、FadD、Irr、および ABCtp 遺伝子が上方制御されていることを見出した (log2 FC 0.852、1.724、および 5.485)。 PPI ネットワークは、FadD が間接的に ABCtp に接続されていることを示しました。 我々は、B. japonicum の FadD と Xcc の RpfB の間で、類似したタンパク質の折り畳みパターン、機能ドメイン、および 58% の配列類似性を同定しました。 また、DEG の STRING ベースの分析により、QS および ABC トランスポーター経路を特定しました。 分子ドッキングにより、FadD-DSF と RpfB-DSF の間の結合エネルギーに有意な差が示され、MD シミュレーションによって裏付けられた潜在的な FadD 依存性 DSF 代謝回転が示されました。 我々は、低鉄条件が B. japonicum における fadD 上方制御の模倣的な環境刺激であり、DSF を介した鉄の取り込みと DSF 産生近傍の毒性を不活化するのではないかと推測しています。 我々の結果は、Xcc によって引き起こされる植物病害に対する生物防除剤として B. japonicum または遺伝子組み換え B. japonicum を使用するという新しい選択肢を提供します。 しかし、気候変動に直面しても農業生産を確保するには、FadD 遺伝子編集の探索的研究が将来の研究の重要な焦点となる可能性があります。

Google Scholar (https://scholar.google.com/) および PubMed (https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)。 また、NCBI Gene Expression Omnibus (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) でマイクロアレイ データセットを検索し、分析のために GSE4143 データセットを選択しました (表 3)。 GEO サンプル GSM94778、GSM94780、および GSM94781 は低鉄条件で成長し、GEO サンプル GSM94783、GSM94784、および GSM94785 は高鉄条件で成長しました。 簡単に説明すると、B. japonicum LO 株を、外因性鉄源を含まない改変 GSY 培地で増殖させて培地中の鉄濃度が 0.3 μM (低鉄条件)、および 12 μM FeCl3.6H2O (高鉄条件) を補充した改変 GSY 培地で増殖させました。条件）5．

低鉄条件と高鉄条件で生育した B. japonicum の間で差次的に発現される遺伝子 (DEG) は、GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) を使用して同定されました57。 FDR 調整 P 値 < 0.05 (Benjamin-Hochberg) のカットオフ基準内の遺伝子を DEG とみなしました。 データの対数変換は、力の正規化とリンマ精度の重み (Vooma) を使用して「自動検出」モードに設定されました。 NCBI が生成したプラットフォーム注釈のカテゴリが結果に表示するために選択されました。 結果はタブ区切り形式で取得され、さらなる分析のために Microsoft Excel にエクスポートされました。

重要な DEG の遺伝子シンボルは、KOBAS-京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG)58、59、60 経路 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)61 を使用した遺伝子セットの機能強化に使用されました。有意性のカットオフとして FDR 調整 P 値 < 0.05。 結果は、比較分析のために FDR 調整 P 値 < 0.05 なしで保存されました。

DEG の遺伝子シンボルは、STRING (https://string-db.org/) を使用して PPI ネットワーク全体を構築するために使用されました。 DEG には、生物学的プロセス、分子機能、細胞成分の 3 つの主要なカテゴリに加え、ローカル ネットワーク クラスター (STRING)、キーワード (Uniport)、およびタンパク質のドメインと特徴 (InterPro) 62 の 3 つの主要なカテゴリの下に遺伝子オントロジー用語の注釈が付けられました。信頼度設定 (つまり、合計スコア > 0.4) を設定し、短い表形式のテキスト出力として保存します。 その後、視覚化のために、PPI ネットワーク トポロジが STRING Web サイトから Cytoscape (v3.9.1)63 (http://www.cytoscape.org/) に直接エクスポートされました。 上位 50 のハブ ノードと上位 15 のボトルネック ノードは、cytoHubba (v0.1) プラグイン アプリと Maximal Clique Centrality (MCC) スコアリング方法を使用して特定されました64。 fadD と相互作用するノードが特定され、個別に研究されました。

B. japonicum の FadD (UniProt: A0A0A3XRM6)、Xcc の RpfB (UniProt: Q8P9K5)、E. coli の FadD (GenBank: UBF39181.1)、Agrobacterium tumefaciens (GenBank: CAD0207327.1)、Sinorhizobium meliloti SM11 のタンパク質配列 ( GenBank: AEH77411.1) は、MUSCLE (MEGA v11)65 を使用してアラインメントされました。 進化の歴史は、最尤法と JTT 行列ベースのモデル 66 を使用して推論され、最近傍交換距離がツリー推論オプションとして使用され、1000 回のブートストラップ複製によってテストされました。 進化分析は MEGA v1165 で行われました。 B. japonicum の FadD および Xcc の RpfB のタンパク質ドメインには、InterProScan67 を使用してアノテーションが付けられました。 タンパク質の三次元構造は、TM-align20 と UCSF Chimera19 の RRDistMaps ツールを使用して比較されました。

RpfB (AF-Q8P9K5-F1) および FadD (AF-A0A0A3XRM6-F1) の AlphaFold18 タンパク質構造ファイルを受容体として使用し、拡散シグナル伝達因子 (DSF)、cis-11-methyl-2-dodecenoic の SDF ファイルを使用しました。酸 (PubChem ID: 11469920) を PubChem データベースから取得し、リガンドとして使用しました。 自動ブラインドドッキングは、パラメータを変更せずに 10 回繰り返し、CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php)21 を使用して実行され、平均が解釈に使用されました。 ベストヒットのリガンド-受容体構造がダウンロードされ、さらなる分析のために接触残基のスクリーンショットが保存されました。 受容体とリガンドの相互作用は、無料の Maestro v13.2 (Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2021) を使用して視覚化されました68。 SWISSDock (http://www.swissdock.ch/docking)23 も同じ受容体とリガンドとともに使用されました。 また、AutoDock Vina ドッキング エンジンとの高速ドッキングに fastDRH (http://cadd.zju.edu.cn/fastdrh/overview)24 を使用し、構造を切り詰めた MM/PB(GB)SA エネルギーと-複数のポーズに基づく残余エネルギー分解。 CB-Dock2 から取得した受容体 - リガンド複合体を結合ポケット参照として使用し、10 個のポーズ番号を選択しました。 姿勢の再スコアリングには、受容体力場 ff99SB (TIP3P 水モデルを使用) およびリガンド力場 GAFF2 が選択され、切断半径設定はすべての再スコアリング手順でデフォルト値に維持されました。 ホットスポットの予測は、変更されていない ff99SB 力場とデフォルトの切り捨て半径を使用して実行されました。 ドッキングポーズを評価するために、MM/PBSA および MM/GBSA (残基ごとのエネルギー分解を行うため) が個別に提出されました。 得られた結果はダウンロードされ、さらなる分析に使用されました。

すべての分子動力学 (MD) シミュレーションは、受容体 RpfB および FadD、およびリガンド DSF69 に対する ff99SB および GAFF 力場を備えた AMBER 16 パッケージを使用して実行されました。 AmberTools の前室モジュールを使用して、標準プロトコル 70 に従って半経験的な AM1-BCC 関数を使用してリガンドの部分電荷を計算しました。 複合体は TIP3P 水モデルで溶媒和され、AmberTools パッケージの tLEap 入力スクリプトを使用して Na + イオンを追加することで中和されました。 長距離静電相互作用は、粒子メッシュ Ewald 法 71 を使用してモデル化されました。 SHAKE アルゴリズム 72 は、水素原子を含む共有結合の長さを制限するために適用されました。 システムの温度を 310 K で平衡化するためにランジュバン サーモスタットが実装されました。すべての MD セットアップで 2.0 fs タイム ステップが使用されました。 最小化フェーズと平衡化 (NVT および NPT アンサンブル) フェーズでは、それぞれ 100,000 ステップと 1 ns の期間が使用されました。 最後に、NPT アンサンブルとしての制約なしで、ポアソン・ボルツマン (MM-PBSA) または一般化ボルン (MM-GBSA) 法と拡張された分子力学を組み合わせた分子力学を使用して、各受容体 - リガンド複合体に対して 100 ns の古典的 MD シミュレーションを実行しました。疎水性溶媒がアクセス可能な表面積の用語73,74。 MM-PBSA/GBSA 溶媒和モデルは、自由エネルギー (ΔGpbsa およ​​び ΔGgbsa) を計算するための後処理最終状態法として適用されました。

現在の研究中に分析されたデータセット GSE4143 は、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE4143 で入手できます。

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本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金（科研費）（助成金番号 18K19674、18KK0436、20H00562）および日本医療研究開発機構（助成金 20wm0225012h0001 および 21fk0108129h0502）の助成を受けて行われました。 ）FMに。 著者らは、German Research Foundation (DFG) から助成金番号 INST 93/878-1 FUGG を通じて資金提供を受けた Thomas Dandekar 教授とヴュルツブルク大学 IT センターが提供したコンピューティング リソースとサポートに感謝の意を表します。 この研究は、ITMO フェローシップおよび教授プログラムを通じてロシア連邦政府によって財政的に支援されました。 著者らは、FSER-2021-0013 プロジェクトと ITMO フェローシップ プログラムのインフラストラクチャ サポートに感謝します。 この原稿の草稿を編集してくださった Edanz (https://jp.edanz.com/ac) の Margaret Biswas 博士に感謝します。

ITMO大学、情報化学科学センター、化学情報学研究室、サンクトペテルブルク、ロシア連邦

クナル・ダッタ & セルゲイ・シチャコフ

微生物ゲノミクスと生態学、広島大学IDEC研究所、東広島市

Fumito Maruyama

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KD、SS、FM が主原稿を書き、KD が表と図を作成しました。 著者全員が原稿をレビューしました。

クナル・ダッタ、セルゲイ・シチャコフ、丸山文人への往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Dutta, K.、Shityakov, S.、および丸山 F. DSF 不活化因子 RpfB 相同 FadD は、鉄制限条件下で Bradyrhizobium japonicum で上方制御されました。 Sci Rep 13、8701 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35487-9

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受領日: 2022 年 12 月 31 日

受理日: 2023 年 5 月 18 日

公開日: 2023 年 5 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35487-9

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